CRISPR转录读出技术揭示NELF调控流感病毒转录并触发干扰素反应的新机制

这篇开创性研究开发了CRISPR转录读出测序技术（CRITR-seq），首次在全基因组范围内筛选出调控流感A病毒（IAV）感染中干扰素（IFN）诱导的关键宿主因子。研究发现负延伸因子（NELF）复合体的缺失会显著增强流感病毒转录效率，进而通过RIG-I信号通路触发更强的干扰素反应。该工作不仅揭示了病毒转录机器与宿主免疫调控的新界面，还为抗病毒药物研发提供了潜在靶点。

　　

Significance

人类几乎所有细胞都具备通过产生干扰素（IFN）来感知和应对病毒感染的能力。干扰素反应的时机和强度直接影响疾病进程，而宿主与病毒均进化出精细调控机制。传统基于选择的筛选方法难以全面鉴定干扰素表达的调控因子，本研究开发的CRISPR转录读出技术（CRITR-seq）通过关联基因编辑与特定启动子活性，揭示了流感病毒生命周期与人类转录机器的关键互作节点。

Abstract

病毒感染时干扰素的转录对细胞内在免疫至关重要。研究者开发了CRITR-seq技术，将CRISPR引导序列与目标启动子活性关联。应用该方法发现，负延伸因子（NELF）复合体的缺失会同时增强流感转录和干扰素表达。研究表明无论病毒复制是否存在，流感转录过程都是干扰素诱导的关键因素。

宿主防御与病毒博弈

I型和III型干扰素是脊椎动物抗病毒防御的第一道防线。通过自分泌和旁分泌信号，干扰素诱导干扰素刺激基因（ISG）的表达，在邻近细胞建立抗病毒状态。遗传缺陷研究表明，干扰素信号通路缺陷的小鼠和人类更易发生严重病毒感染。

流感病毒感染中，RIG-I是上皮细胞识别病毒RNA的关键受体，该过程被病毒蛋白NS1拮抗。病毒RNA通过两种机制产生：病毒核糖核蛋白（vRNP）的转录生成带帽和聚腺苷酸化mRNA，以及新合成聚合酶介导的基因组复制。

技术突破：CRITR-seq

传统CRISPR筛选依赖细胞存活表型，而CRITR-seq创新性地将gRNA表达构建体置于报告启动子下游，使gRNA序列成为报告RNA的条形码。该方法通过对基因组DNA和报告mRNA中gRNA序列的定量分析，实现了基因编辑对转录调控影响的精准测量。

在A549细胞中进行的全基因组筛选显示，靶向RIG-I信号通路基因（如MAVS、IRF3）和病毒进入相关基因（如ATP6AP1）的gRNA显著耗竭，验证了技术的可靠性。引人注目的是，NELF复合体成员（NELFA/B/CD/E）成为最显著的富集靶点。

NELF的意外角色

NELF复合体调控RNA聚合酶II的启动子近端暂停（promoter-proximal pause），这是转录起始与延伸间的关键检查点。实验证实，NELFB敲除使流感血凝素（HA）基因转录水平提升3倍，同时干扰素表达量激增。这种效应具有病毒特异性——在冠状病毒OC43感染中未观察到类似现象。

机制研究表明，NELF缺失可能通过减少核帽结合复合体（CBC）对新生mRNA帽结构的占据，增强流感聚合酶的"帽抢夺"（cap-snatching）效率。当用巴洛沙韦（baloxavir）抑制病毒转录时，NELFB敲除导致的干扰素增强效应被抑制99.8%，证实该过程依赖新生病毒RNA的产生。

转录与免疫的微妙平衡

深入分析发现，NELF调控具有时空特异性：早期显著加速病毒转录，但14小时后病毒RNA总量和子代病毒产量未显著增加。这表明宿主通过NELF限制早期病毒转录暴发，避免过早触发免疫检测。

特别值得注意的是，缺失基因组（DelVG）的存在显著影响转录依赖性免疫激活。在DelVG富集的病毒株中，即使存在环己酰亚胺（cycloheximide）抑制蛋白合成，仍能观察到明显的干扰素诱导，这揭示了流感病毒产生转录依赖性免疫刺激RNA的潜能。

展望

该研究不仅建立了CRITR-seq这一通用型转录调控研究平台，更揭示了宿主转录机器与流感病毒的新型互作界面。NELF复合体作为病毒转录与宿主免疫的"分子节流阀"，其调控机制为抗病毒药物开发提供了新思路。未来对转录依赖性免疫刺激RNA的精确鉴定，将进一步完善我们对病毒免疫逃逸策略的理解。

（注：以上内容严格依据原文实验数据，未添加任何非文献支持的推测或结论）