水稻中基于NG或NGG-PAM配对pegRNA的Prime编辑系统效率比较研究

这篇研究通过比较野生型nSpCas9(PE-wt)与NG变体nSpCas9-NG(PE-NG)在配对工程化pegRNA(epegRNA)介导下的Prime编辑(PE)效率，揭示了NGG-PAM远端靶向策略在编辑效率上显著优于NG-PAM近端靶向方案，尤其在NGC-PAM位点表现突出。研究为水稻基因组精准编辑提供了PAM选择策略，并验证了OsEPSPST173I/P177S突变体的除草剂抗性功能。

　　

1 引言

Prime编辑(PE)技术通过融合nCas9蛋白与逆转录酶(RT)，结合特殊设计的pegRNA，可实现12种碱基替换及定制化插入缺失。研究团队前期开发的配对epegRNA系统，通过3'端添加RNA假结序列增强稳定性，显著提升了编辑效率。然而传统SpCas9(PE-wt)依赖NGG-PAM的特性限制了靶点选择，而SpCas9-NG变体(PE-NG)对NG-PAM的识别将理论可编辑范围从21.5%提升至89.2%。

2 方法

实验采用水稻品种日本晴和山田早生，通过农杆菌介导转化胚胎盾片来源的愈伤组织。载体构建中，epegRNA通过pegFinder等工具设计，包含20nt向导序列、RT模板和8nt连接子。PE-NG载体采用水稻密码子优化的SpCas9-NG(N863A)与工程化M-MLV RT(D200N/L603W等突变体)融合表达。突变检测采用Sanger测序，编辑效率计算为突变阳性愈伤组织占比。

3 结果

3.1 编辑效率比较

在OsEPSPS基因引入T173I/P177S突变时，PE-wt编辑效率(5.6%)显著高于PE-NG(1.9%)。类似趋势见于OsHSL1^F140H(>20% vs <5%)和OsDL^C44stop(55.21% vs 3.82%)。值得注意的是，当PE-NG的epegRNA靶向NGC-PAM时效率最低，而NGA/NGT-PAM靶向时与PE-wt无显著差异。

3.2 再生植株分析

从PE-wt转化的愈伤组织再生的植株中，OsEPSPS^TIPS突变检出率(100%株系)远超PE-NG(仅16.7%)。OsHSL1^F140H突变体表现出预期的除草剂抗性，但OsEPSPS^TIPS纯合突变导致致死，符合该突变体酶活性降低的报道。

4 讨论

SpCas9-NG在NGC-PAM位点的低活性是效率差异的主因，这与人类细胞中观察到的PAM偏好性一致。研究建议优先选择NGG-PAM靶向策略，次选NGD-PAM方案。实验同时发现编辑效率提升会伴随支架序列副产物增加，提示需结合高保真epegRNA-HF设计。

5 结论

研究系统比较了不同PAM配置下的PE效率，为水稻精准编辑提供了明确的操作指南：首选NGG-PAM远端靶向的PE-wt系统，次选NGD-PAM靶向的PE-NG方案。该成果对农作物性状改良具有重要实践意义。