植物pTARGEX载体工具箱：实现多亚细胞定位的异源蛋白高效表达新策略

这篇综述介绍了pTARGEX载体工具箱的开发与应用，该系统通过整合亚细胞定位序列（如ER的KDEL、液泡的CTPP等）和可视化筛选标记（mCherry/eGFP），实现了在烟草（N. benthamiana）和蒺藜苜蓿（M. truncatula）中针对细胞质、内质网、液泡、质体和质外体五种亚细胞区室的精准蛋白定位。研究验证了SARS-CoV-2 RBD和mScarlet蛋白的区室特异性积累规律，为植物分子农业（PMF）和合成生物学研究提供了模块化、开源的技术平台。

　　

引言

植物分子农业（Plant Molecular Farming）利用植物系统生产高价值生物分子，如疫苗（如Medicago的VLP流感疫苗）、治疗性蛋白（如ZMapp埃博拉抗体）和工业酶。本研究开发的pTARGEX载体系列通过亚细胞定位策略优化蛋白积累，填补了现有工具在快速平行测试定位策略方面的空白。

材料与方法

载体构建采用Gibson Assembly和Golden Gate克隆技术，整合了烟草PR1b信号肽（内质网/液泡靶向）、Rubisco小亚基质体转运肽（叶绿体靶向）等元件。载体含LacP-mCherry筛选标记和组成型表达的eGFP报告基因，通过农杆菌（A. tumefaciens AGL1）介导的烟草瞬时转化和发根农杆菌（A. rhizogenes ARqua1）转化蒺藜苜蓿根系进行功能验证。

结果

亚细胞定位验证

mScarlet在烟草叶片中呈现区室特异性分布：pTARGEX-APO通过质壁分离实验证实定位于质外体；pTARGEX-ER显示网状内质网结构；pTARGEX-CHL在烟草中因表达过量出现胞质/核泄漏，但在蒺藜苜蓿根系中严格定位于质体。

蛋白积累差异

SARS-CoV-2 RBD在细胞质（pTARGEX-CYT）积累最高，其次是内质网（pTARGEX-ER），而质外体和液泡靶向构建体表达量显著降低。Western blot检测到叶绿体靶向mScarlet存在35 kDa未切割前体，提示转运肽加工效率受限。

eGFP标记应用

尽管NOS启动子驱动的eGFP在烟草叶片中可通过共聚焦显微镜检测，但在根系中荧光信号较弱，未能实现抗生素替代筛选的预期目标。

讨论

该研究揭示了亚细胞环境对蛋白稳定性的显著影响：ER保留的RBD可能获得N-糖基化修饰，而胞质表达虽产量高但缺乏翻译后加工。载体设计中的mCherry筛选模块和eGFP报告系统为克隆验证和转化效率监测提供了双重保障。

结语

作为iGEM本科生主导的项目，pTARGEX系列兼具教育价值和科研实用性，其开源特性支持全球研究者进一步优化植物表达系统，特别是在疫苗生产和治疗性蛋白开发领域。未来可通过诱导型启动子或强化转运肽设计提升叶绿体靶向效率。