靶向STAT6通过抑制花生四烯酸分流增强肝癌对塞来昔布敏感性的全基因组CRISPR/Cas9筛选研究

本研究针对肝癌患者长期使用塞来昔布(celecoxib)产生耐药性的临床难题，通过全基因组CRISPR/Cas9筛选发现STAT6是调控花生四烯酸(AA)分流的关键转录因子。研究人员证实STAT6通过同时调控ALOX15、ALOX12和CYP2E1的表达促进AA分流，而靶向STAT6可显著增强肝癌细胞对塞来昔布的敏感性。该研究为克服塞来昔布耐药性提供了新策略，STAT6抑制剂AS1517499与塞来昔布的联合治疗方案具有重要临床转化价值。

　　

肝癌是全球第六大常见癌症，每年新增病例超过90万例，其高死亡率使其成为重大公共卫生问题。目前临床治疗手段有限，靶向药物如索拉非尼(sorafenib)和乐伐替尼(lenvatinib)响应率低且副作用大。塞来昔布作为选择性COX-2抑制剂，在肝癌治疗中展现出潜力，但长期使用会导致耐药性，迫使增加剂量进而引发严重不良反应。这一困境的核心在于"花生四烯酸(AA)分流"现象——当COX-2通路被抑制时，肿瘤细胞会通过上调其他代谢酶(如ALOX和CYP家族)继续利用AA合成促增殖物质。然而，AA分流是否存在于肝癌、其具体调控机制以及如何针对性干预，这些关键问题尚未阐明。

为系统解决这些问题，研究人员在《Cell Communication and Signaling》发表了创新性研究成果。研究团队首先建立了稳定的CRISPR/Cas9系统，通过全基因组sgRNA文库筛选，结合体内外功能实验和分子机制研究，发现STAT6是调控AA分流的关键枢纽。研究证实STAT6抑制剂AS1517499与塞来昔布联用可产生强协同效应，为肝癌治疗提供了新策略。

研究采用多项关键技术：1)全基因组CRISPR/Cas9文库筛选鉴定耐药相关基因；2)药物敏感性检测(CCK-8和3D球体形成实验)；3)代谢产物检测(ELISA法测定PGE₂、12-HETE和14,15-EET水平)；4)分子机制研究(ChIP-qPCR、双荧光素酶报告基因等)；5)体内疗效评估(裸鼠移植瘤模型)。样本来源于人肝癌细胞系HepG2和JHH7。

建立肝癌细胞Cas9系统

研究人员首先在HepG2和JHH7细胞中稳定表达Cas9酶，验证其不影响基础生物学特性后，通过靶向CTNNB1基因证实了CRISPR系统的高效性。这为后续全基因组筛选奠定了技术基础。

体内CRISPR筛选揭示AA分流机制

通过全基因组sgRNA文库的体内筛选，在HepG2和JHH7细胞中分别鉴定出1,204和1,221个耐药相关基因。通路分析显示"AA代谢"是两种细胞共有的关键通路。代谢检测证实塞来昔布处理后，COX-2产物PGE₂降低，而ALOX产物12-HETE和CYP产物14,15-EET显著升高，首次在肝癌中证实了AA分流现象。

肝癌细胞通过不同ALOX/CYP酶实现AA分流

研究发现两种肝癌细胞通过上调不同酶介导AA分流：HepG2主要上调ALOX15、ALOX12和CYP2E1，而JHH7则偏好ALOX15、ALOXE3和CYP2E1。短期实验显示敲除这些酶可增强塞来昔布敏感性，但长期3D球体实验表明单一酶靶向效果有限。

STAT6作为核心调控因子

生物信息学预测STAT6可同时调控ALOX15、ALOX12和CYP2E1。实验证实STAT6在塞来昔布刺激下磷酸化增强，与靶基因启动子结合增加。ChIP-qPCR显示STAT6在HepG2中结合ALOX15/12/CYP2E1启动子，在JHH7中结合ALOX15/CYP2E1启动子。临床数据分析显示STAT6/ALOX15/ALOX12/CYP2E1特征与肝癌不良预后相关。

STAT6敲除增强塞来昔布敏感性

STAT6敲除使HepG2和JHH7细胞对塞来昔布的IC₅₀分别降低3倍和4.4倍。机制上，STAT6敲除显著抑制了12-HETE和14,15-EET的产生。添加这些代谢物可部分逆转STAT6敲除的增敏效应，证实其通过抑制AA分流发挥作用。体内实验进一步验证了这一结论。

STAT6抑制剂展现协同效应

在8种STAT6抑制剂中，AS1517499对正常肝细胞毒性最低(IC₅₀=309.468 μM)，而对肝癌细胞抑制最强(HepG2 IC₅₀=1.373 μM)。联合指数(CI)分析显示AS1517499与塞来昔布在多数浓度下呈现中度至强协同效应(CI<0.6)。体内实验证实该组合显著抑制肿瘤生长且无明显毒性。

这项研究首次系统阐明了STAT6在肝癌AA分流中的核心调控作用，解决了塞来昔布耐药的关键机制问题。创新性发现包括：1)STAT6可同时调控多个AA代谢酶；2)不同肝癌细胞存在差异调控模式；3)STAT6抑制剂与塞来昔布联用具有强协同效应。这些发现不仅为克服塞来昔布耐药提供了新靶点，也为肝癌联合治疗开辟了新途径。研究局限性在于STAT6激活的上游机制和细胞特异性调控基础尚未完全阐明，这将是未来研究的重要方向。