中通量实验室重现高通量表型分析技术Cell Painting在化学品风险评估中的应用与验证

本研究针对传统毒性评估方法效率低、成本高的问题，创新性地将384孔板高通量表型分析技术(HTPP)适配至96孔板体系。研究人员通过优化Cell Painting染色方案，结合高内涵成像和Mahalanobis距离分析，成功在U-2 OS细胞中重现了12种参考化合物的表型基准浓度(BMC)。结果显示96孔板与384孔板数据具有良好一致性（差异<1个数量级），证实该技术在不同通量实验室间的可转移性，为扩大表型分析在化学品风险评估中的应用提供了重要方法学支撑。

　　

在化学品无处不在的现代环境中，传统毒性测试方法正面临严峻挑战。动物实验耗时耗力，而常规体外检测又难以捕捉化学物质引发的复杂细胞反应。美国环境保护署(EPA)等机构近年推广的高通量表型分析(High-Throughput Phenotypic Profiling, HTPP)技术——特别是结合多重荧光染色的Cell Painting方法——能同时捕获细胞器形态、骨架结构等上千个特征参数，为毒性评估提供了全新视角。然而，依赖384孔板的高通量系统将众多中小型实验室拒之门外，阻碍了该技术的广泛应用。

这项发表在《Archives of Toxicology》的研究破解了这一困局。Eunnara Cho团队创新性地将EPA建立的384孔板Cell Painting方案"压缩"至96孔板体系，通过四轮独立实验验证了12种已知表型调节化合物在U-2 OS人骨肉瘤细胞中的响应特征。研究发现96孔板获得的基准浓度(Benchmark Concentration, BMC)与384孔板文献值高度吻合（10/12化合物差异<1个数量级），且实验内重复性良好。更值得关注的是，团队首次系统评估了细胞密度对Mahalanobis距离计算的影响，发现采用局部对照（如固定列位）可有效降低技术偏差，为中小型实验室开展表型分析提供了关键质控依据。

研究主要采用四大技术方法：(1) 96孔板Cell Painting染色方案优化，使用Hoechst 33,342等6种荧光染料标记细胞器；(2) Opera Phenix高内涵成像系统采集9个视野/孔的细胞图像；(3) Columbus软件提取1300个形态特征值；(4) 基于R语言构建的计算流程，通过主成分分析(PCA)和Mahalanobis距离建模计算BMC。所有实验均使用ATCC来源的U-2 OS细胞，在3个传代次数内完成。

【BMC变异性分析】通过四轮独立实验发现，10种参考化合物的BMC在实验间差异小于1个数量级，其中EPA推荐的4种质控化合物（berberine chloride等）表现尤为稳定。与384孔板数据对比显示，96孔板获得的BMC多处于文献值的下限区间，提示可能具有更高灵敏度。

【技术影响因素】全板DMSO对照实验揭示细胞密度与Mahalanobis距离呈显著负相关（R²=16.3%）。当采用列特异性对照时，该相关性减弱至R²<11%，说明实验设计可显著降低技术变异。

【数据可比性】重新分析EPA公开数据集显示，本研究构建的计算流程所得BMC与原始文献值高度一致（12/14化合物差异<1个数量级），验证了分析方法的重现性。

这项研究证实Cell Painting技术具有优异的平台间可转移性，打破了对高通量设备的绝对依赖。通过建立96孔板标准化方案，使更多实验室能参与表型数据库的构建，加速"21世纪毒性测试"愿景的实现。特别在细胞密度影响方面的发现，为优化实验设计提供了实证依据。尽管小样本量导致的Mahalanobis距离计算稳定性问题仍需改进，但该工作无疑推动了表型分析在风险评估中的广泛应用，为构建多维度毒性证据链奠定了方法学基础。随着更多实验室采用该方案，未来有望建立跨平台的表型-转录组关联模型，更全面揭示化学品的毒性机制。