基于蜘蛛丝启发的肽-聚电解质复合凝聚体：通过交联和盐诱导老化调控二级结构形成与力学性能

本研究针对人工合成蜘蛛丝蛋白表达困难、加工机制不清的难题，设计了一种含寡丙氨酸链的聚电解质共聚物，通过液-液相分离(LLPS)形成复合凝聚体(coacervates)。利用流变学、粘附测试和固态核磁共振(ssNMR)技术，发现β-折叠和α-螺旋二级结构可交联材料，显著提升3D打印性能，并首次观察到盐浓度依赖的老化现象，为仿生材料开发提供新思路。

　　

蜘蛛丝作为自然界最卓越的生物材料之一，兼具生物相容性、可降解性和卓越的机械性能。然而，由于蜘蛛丝蛋白(spidroins)特殊的氨基酸组成（60%以上为丙氨酸和甘氨酸）和超大分子量（250-350 kDa），其重组表达面临tRNA库不足和溶解度低的双重挑战。更关键的是，蜘蛛体内通过液-液相分离(LLPS)形成高浓度纺丝原液的自然加工机制尚未完全阐明，导致人工纺丝常需依赖有机溶剂。这些瓶颈严重制约了蜘蛛丝在神经修复、皮肤再生等生物医学领域的应用潜力。

为解决这一难题，荷兰格罗宁根大学Guillermo Monreal Santiago团队在《Communications Chemistry》发表创新研究，通过合成含寡丙氨酸链的聚电解质共聚物(GPB)，模拟蜘蛛丝蛋白的重复结构域，并结合复合凝聚现象构建仿生体系。研究人员采用两步法合成策略：首先通过自由基聚合制备含5%氨基接枝点的聚阳离子主链，随后通过N-羧基环内酸酐(NCA)开环聚合接枝平均6个丙氨酸的寡肽链。通过流变学测试、探针粘附实验、固态核磁共振和共聚焦显微技术，系统研究了材料力学性能与二级结构的关系。

研究团队发现含寡丙氨酸的凝聚体展现出三大突破性特征：首先，储能模量提升1000倍，实现从粘弹性液体到固体的转变，使无支撑3D打印成为可能。如图1d所示，普通凝聚体在打印15分钟后完全塌陷，而含肽样品能保持精细结构。其次，固态核磁共振揭示β-折叠(60%)和α-螺旋(23%)的共存（图4），这些刚性二级结构通过超分子作用形成交联网络。尤为重要的是，首次观察到盐浓度依赖的老化现象——增加NaCl浓度(0.1→0.4 M)反而加速材料固化，这与传统凝聚体行为完全相反（图2c）。研究人员提出双交联机制解释该现象：静电作用快速形成初始网络，而肽链重排需要数小时达到热力学平衡，盐通过削弱静电作用"释放"分子运动能力。

技术方法上，研究结合了：(1)可控自由基聚合与NCA开环聚合制备肽-聚电解质共聚物；(2)流变学频率扫描和时间扫描分析力学性能；(3)魔角旋转固态核磁共振(¹³C/¹⁵N MAS ssNMR)解析二级结构；(4)硫黄素T(ThT)染色共聚焦显微技术定位β-折叠聚集态；(5)探针粘附试验评估大变形下的力学响应。

研究结果部分揭示多个重要发现：

1. 1.

   合成与相行为：成功制备含寡丙氨酸的聚电解质共聚物(GPB)，其与聚丙烯酸(pAA)形成的凝聚体在3 M NaCl下仍保持相分离（图S8），表明肽交联与静电作用正交。

2. 2.

   力学性能提升：含5%寡丙氨酸的GPB/pAA凝聚体储能模量达10⁴ Pa，比对照高3个数量级（图2a,e）。非接枝肽(HP+NG-Ala)也能通过物理嵌入增强材料，但在大变形下效果显著减弱（图3）。

3. 3.

   二级结构特征：固态核磁显示β-折叠(Cβ 20.3 ppm)为主导构象，同时存在α-螺旋(Cβ 16.8 ppm)和随机 coil结构（图4,5）。二维相关谱发现两类β-折叠(<>₁>和<>₂>)的紧密接触（距离<7?）。

4. 4.

   聚集态分布：共聚焦显微显示接枝肽均匀分布，而非接枝肽形成微米级β-折叠聚集体（图6c-e），这解释了二者力学性能差异。

讨论部分指出，该研究不仅为理解蜘蛛丝加工中LLPS与肽交联的协同作用提供简化模型，更开创性地展示盐浓度可调控材料老化动力学。虽然合成材料的力学性能尚未达到天然蛛丝水平，但其模块化设计支持快速筛选不同氨基酸组成、肽链长度和接枝密度的影响。未来通过引入剪切流动、盐梯度等纺丝条件，有望进一步模拟天然丝纤维的形成过程。

这项研究的重要意义在于：(1)建立首个同时整合LLPS和肽交联的蜘蛛丝仿生系统；(2)发现盐诱导老化这一反常规现象，拓展对生物分子凝聚体动力学的认知；(3)开发出可3D打印的肽交联凝聚体平台技术；(4)为设计新型仿生软材料提供普适性策略——仅需5%接枝率即可实现材料性能的质的飞跃。该成果将推动从分子层面理解生物材料自组装机制，并为开发绿色加工的高性能材料开辟新途径。