激光闪融技术突破冷冻电镜样品取向偏好难题

本研究针对冷冻电镜（cryo-EM）单颗粒分析中蛋白质在气液界面吸附导致的取向偏好问题，开发了微秒级激光闪融技术。通过矩形脉冲和波形脉冲两种模式，成功实现了T20S蛋白酶体、50S核糖体亚基等不同尺寸/对称性蛋白质的取向随机化，最高使分辨率提升1.2 ?。该技术可无缝整合现有工作流程，为结构生物学研究提供新工具。

　　

冷冻电镜（cryo-EM）已成为结构生物学研究的利器，但样品制备过程中的"取向偏好"问题长期困扰研究者——当蛋白质吸附在气液界面时，往往呈现有限的取向分布，导致重建图谱分辨率各向异性甚至项目失败。传统解决方案如样品倾斜、界面阻断剂等存在操作复杂、普适性差等局限。Monique S. Straub团队在《Nature Methods》发表的这项研究，创新性地利用激光物理手段破解了这一难题。

研究采用微秒时间分辨冷冻电镜技术，核心方法包括：1）矩形激光脉冲（20-30 μs）闪融样品；2）波形脉冲（1 μs高强度前导边沿）加速加热；3）原位沉积20 nm非晶冰层阻断界面吸附。实验以T20S蛋白酶体（D₇对称）、50S核糖体亚基（C₁不对称）、HIV-1包膜蛋白（210 kDa）和血凝素（170 kDa）为模型系统，通过冷冻电镜数据采集与cryoSPARC软件分析评估效果。

矩形脉冲闪融效果

对T20S蛋白酶体，采样补偿因子（SCF）从0.89提升至0.95；50S核糖体亚基的SCF更从0.42跃升至0.74，重建分辨率提高1.2 ?。但血凝素因强界面吸附仅显示取向分布微调，表明技术效果存在蛋白依赖性。

波形脉冲增强机制

采用10倍功率的1 μs前导脉冲（加热速率2×10⁸ K/s），50S核糖体SCF*达0.90，证实粒子重取向主要源于激光诱导的薄膜振荡而非暂态结晶。该发现推翻团队先前假设，为机制研究提供新视角。

非晶冰层阻断实验

沉积20 nm非晶冰层后闪融，50S核糖体仍显示新取向偏好（SCF* 0.90），证实粒子在液态期间会重新扩散至改性界面。该实验成功分离"解吸附"与"再吸附"两个竞争过程（图4），为界面工程改良奠定基础。

研究结论指出，激光闪融通过微秒级物理扰动打破蛋白质-界面平衡，其效果取决于：1）加热速率决定的解吸附效率；2）粒子扩散返回界面的时间尺度。该技术不仅可节省传统方法18倍的数据量需求，更能与石墨烯载体、机器学习等现有方案协同使用。团队正在开发界面化学改性等衍生技术，进一步拓展应用边界。这项工作为冷冻电镜研究提供了"即插即用"的物理解决方案，标志着取向偏好调控从经验摸索进入定量设计新阶段。