基于NIR-II比率荧光纳米探针的颗粒酶B激活成像技术用于肿瘤免疫治疗早期响应监测

本研究针对肿瘤免疫治疗响应监测的临床挑战，开发了一种新型近红外二区(NIR-II)比率荧光纳米探针DCGA。通过特异性检测细胞毒性T细胞(CTL)关键效应分子颗粒酶B(GzmB)的活性，实现了对肝细胞癌(HCC)免疫治疗响应的早期预测。该探针采用Nd3+/Er3+共掺杂双发射纳米颗粒，结合可被GzmB切割的肽段和NIR染料A1094，在PDX模型和临床前模型中成功区分了免疫治疗响应者与非响应者，为精准医疗提供了新型分子影像工具。

　　

在肿瘤免疫治疗领域，一个令人困扰的现状是仅有不足25%的患者能获得持续治疗响应。当前通过血液淋巴细胞分析或组织活检等传统方法，不仅具有侵入性，更难以捕捉免疫应答的动态时空信息。特别是细胞毒性T淋巴细胞(CD8⁺ T细胞)作为免疫治疗的核心效应细胞，其数量、定位和激活状态的实时监测成为评估疗效的关键。颗粒酶B(GzmB)作为T细胞介导的细胞毒性关键效应分子，成为理想的生物标志物，但现有成像技术面临组织穿透深度不足、单通道成像局限等问题。

为解决这一难题，Lei Ding、Xiaolong Zhang等研究团队在《Nature Communications》发表了创新性研究成果。研究人员构建了基于稀土元素的NIR-II比率荧光纳米探针DCGA，通过Nd³⁺（1060 nm）和Er³⁺（1525 nm）双发射中心设计，结合GzmB特异性切割肽和FRET淬灭染料A1094，实现了对T细胞激活过程的高灵敏度、高特异性成像。该研究采用核心-壳层结构的β-NaErF₄@NaYF₄@NaYF₄:10%Nd@NaYF₄纳米颗粒，通过肽段修饰和染料负载构建智能探针，并在Hepa 1-6小鼠模型和肝癌患者来源异种移植(PDX)模型中验证了其应用价值。

双发射纳米探针的构建与表征

研究团队通过逐层生长法合成具有核壳结构的稀土掺杂纳米颗粒(DCNPs)，TEM显示DCGA探针尺寸约80×50 nm，动态光散射(DLS)证实其水合粒径为68-91 nm。紫外-可见-近红外吸收光谱显示A1094在1094 nm的特征吸收峰与Nd³⁺的1060 nm发射峰重叠，实现85.3%的FRET淬灭效率。体外实验表明，该探针对0.3 μM GzmB响应时荧光恢复率达8.2倍，检测限低至41.6 nM，且对其它蛋白酶保持高度特异性。

细胞水平验证探针性能

通过anti-CD3e/CD28抗体激活的CD8⁺ T细胞显示，DCGA能特异性区分激活态（GzmB阳性）与未激活T细胞。在CTL与Hepa 1-6细胞共培养体系中，当效靶比(E:T)达10:1时，比率信号(F_1060nm/F_1525nm)提升2.45倍，且与LDH释放率(r=0.9521)和ELISA检测的GzmB浓度(r=0.9473)高度相关。

体内成像预测免疫治疗响应

在PMA/离子霉素诱导的T细胞激活模型中，DCGA比率信号在诱导组较对照组提升1.69倍。应用三种免疫调节剂（IDO抑制剂NLG919、PD-1/PD-L1阻断剂BMS-1、精氨酸酶抑制剂BEC）治疗时，DCGA在治疗第10天即可通过比率信号差异（BEC组较对照高1.89倍）预测第22天的肿瘤抑制效果，且信号强度与CD3⁺CD8⁺ T细胞浸润量(r=0.9482)呈正相关。在PDX模型中，激活的CD8⁺ T细胞治疗组比率信号较未激活组高1.76倍，并准确预测了第24天的肿瘤生长抑制。

免疫机制相关性分析

流式细胞术显示BEC治疗组CD3⁺CD8⁺ T细胞浸润量较对照组增加2.26倍。免疫荧光证实治疗组肿瘤内CD8⁺（绿色）与GzmB（红色）共定位显著增强，TUNEL染色显示广泛凋亡，Ki67染色显示增殖抑制，这些发现与DCGA成像结果高度一致。

这项研究开创性地将NIR-II比率成像技术与免疫监测相结合，解决了传统方法无法实时量化T细胞活化的难题。DCGA探针的独特优势体现在：① 双发射自校准消除探针分布不均的干扰；② 1525 nm参考信号穿透深度达厘米级；③ 可区分毫米级肿瘤微环境中的免疫异质性。该技术为临床免疫治疗疗效预测提供了新型分子影像工具，对个体化治疗方案制定具有重要转化价值。未来通过整合多靶点响应模块，有望进一步推动精准免疫诊疗的发展。