多细胞因子联合抗CD2/抗NKp46抗体刺激高效生成嵌合抗原受体转导原代人自然杀伤细胞的新方法

为解决临床剂量基因修饰自然杀伤(NK)细胞制备难题，日本新潟大学团队开发了基于多细胞因子(IL-2/12/18/21)联合抗CD2/抗NKp46抗体刺激的无饲养细胞扩增体系。该研究实现了NK细胞纯度>90%、1549倍扩增效率，并通过RD114假型逆转录病毒载体成功构建抗CD19-BB-ζ CAR-NK细胞，对B细胞肿瘤展现显著杀伤活性，为异体癌症免疫治疗提供了新方案。

　　

在癌症免疫治疗领域，嵌合抗原受体(CAR)修饰的T细胞疗法虽取得突破，但面临自体来源限制、制造延迟及严重副作用等瓶颈。自然杀伤(NK)细胞因其天然抗肿瘤活性且不引发移植物抗宿主病(GVHD)，成为理想的异体治疗选择。然而，NK细胞仅占外周淋巴细胞的5-15%，传统依赖K562白血病饲养细胞的扩增方法存在致癌污染风险、成本高昂等问题，严重制约临床转化。

日本新潟大学Kubo Nobuhiro团队在《Biomedicine》发表创新研究，通过组合四种关键细胞因子(IL-2/12/18/21)及抗CD2/抗NKp46激动抗体，建立无饲养细胞的NK细胞扩增体系。研究使用健康成人外周血单个核细胞(PBMCs)，通过流式细胞术评估表型特征，RNA测序分析转录组差异，并采用RD114假型逆转录病毒载体进行基因修饰，最终通过细胞毒性实验验证功能。

研究结果：

1. 1.

   高效扩增原代人NK细胞

   培养21天时NK细胞纯度达91.1±7.5%，扩增1549±880倍，显著优于无抗体刺激组。CD25/CD69等激活标志物动态变化，NKG2D/NKp30等受体表达特征提示细胞高度活化。

2. 2.

   转录组特征解析

   与静息NK细胞相比，扩增细胞上调3027个基因（如CCR4/CCR7），下调2784个基因（如CCR5/CXCR1）。通路分析显示粒细胞激活、PI3K-Akt信号等显著富集。

3. 3.

   强大抗肿瘤活性

   扩增NK细胞对K562髓系白血病细胞的4小时杀伤率显著高于原代NK细胞。长期培养实验中，其清除白血病细胞能力与饲养细胞扩增的常规NK细胞相当。

4. 4.

   高效CAR基因转导

   第6天转导时获得57.9±14.6%效率，CAR-NK细胞14天扩增146.4±50.8倍。CD3⁺细胞仅占0.1±0.1%，有效规避GVHD风险。

5. 5.

   特异性杀伤B细胞肿瘤

   抗CD19-BB-ζ CAR-NK细胞对OP-1/Raji/RS4;11等B细胞恶性肿瘤的杀伤活性显著高于mock组，CD107a脱颗粒和IFN-γ分泌水平显著提升。

该研究突破性地证明，无饲养细胞体系可规模化生产功能性CAR-NK细胞。相较于传统方法，其优势在于：避免致癌风险、简化生产流程、实现高纯度扩增（T细胞污染<0.2%），且细胞具有独特的记忆样特征（高表达NKG2A/CD69）。转录组分析揭示的趋化受体谱改变（如CCR5下调）可能增强肿瘤归巢能力，为实体瘤治疗提供新思路。这项技术为异体"现货型"免疫细胞产品的临床转化奠定基础，尤其适合淋巴瘤等B细胞恶性肿瘤的治疗。