β-葡萄糖苷酶N端理性截断策略显著提升热-pH耐受性并促进人参皂苷C-K的高效生物催化合成

本研究创新性地采用N端截断工程改造β-葡萄糖苷酶B6，通过删除33个亲水性残基使突变体（33aa）获得显著提升的热稳定性（最适温度提高10℃至50℃）和酸性耐受性（pH5.0时活性>50%），其底物亲和力（Km=0.8517mmol/L）与结构稳定性（SASA降低、α-螺旋密度增加）同步优化。与嗜热G4葡萄糖苷酶构建的级联系统在人参皂苷C-K生产中实现3.32倍产量提升，为糖苷酶工业化应用提供了普适性改造策略。

　　

Highlight

本研究通过N端截断策略成功解决了糖苷酶在工业化应用中的核心瓶颈——热-pH耐受性不足与多酶系统反应条件不兼容问题。以β-葡萄糖苷酶B6为模型，删除33个亲水性氨基酸的突变体（33aa）展现出三大突破性优势：① 最适温度提升10℃至50℃；② 在酸性环境（pH5.0）保持>50%活性；③ 底物亲和力显著增强（K_m降至0.8517mmol/L）。结构分析揭示其稳定性提升源于溶剂可及表面积（SASA）减少与α-螺旋密度增加的双重效应。

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试剂与材料

实验所用大肠杆菌Trans5α和BL21(DE3)购自北京全式金生物技术有限公司，限制性内切酶NcoI/XhoI购自赛默飞世尔科技。人参皂苷Rb1（99%）和CK（99%）标准品购自上海源叶生物。

人参皂苷Rb1水解特异性糖苷酶筛选

人参属植物中含量最高的原人参二醇型（PPD）皂苷Rb1是制备抗癌活性成分CK的关键前体。其C-3位双糖基与C-20位末端葡萄糖基的选择性水解对酶工程提出严苛要求。

Conclusion

N端截断通过协同优化β-葡萄糖苷酶B6的结构参数（SASA降低、Rg减小、表面电荷重排及二级结构密度增加），实现了热稳定性与催化效率的同步提升。该策略为糖苷酶工业化应用提供了"一石三鸟"的解决方案：条件兼容性优化、催化效率提升及生产成本降低。