高效酶法合成UDP-β-L-阿拉伯糖的创新双酶级联系统：阿拉伯糖激酶与工程化UDP-糖焦磷酸化酶的结构解析

【编辑推荐】本研究首次报道了从Acidobacteriota中鉴定的阿拉伯糖激酶(AbGHMP)和Myxococcales来源的UDP-糖焦磷酸化酶(MbUSP)的协同作用，通过结构引导的E446Y突变体实现97%高收率合成UDP-Ara。该工作解决了植物阿拉伯糖基化研究中的关键技术瓶颈，为糖生物学(Glycobiology)和糖基化技术(Glycotechnology)提供了重要工具。

　　

Highlight

克隆、表达与纯化

密码子优化的AbGHMP基因（NCBI GenBank: MBS1788809.1）被合成并克隆到pET22b载体中。MbUSP基因（NCBI GenBank: MDD9969377.1）则被克隆到改造的pET28a载体中，其中凝血酶蛋白酶位点被TEV酶切位点替代。所有突变体均使用Takara MutanBEST试剂盒构建，并通过DNA测序验证。

AbGHMP蛋白是阿拉伯糖激酶

通过拟南芥ARA1蛋白序列进行BLAST搜索，从Acidobacteriota中鉴定出GHMP激酶AbGHMP（GenBank登录号MBS1788809.1）。系统发育分析（图S1）显示AbGHMP与细菌同源物及植物ARA1共同构成GHMP激酶超家族中的独立分支。酶活实验证实AbGHMP能特异性催化L-阿拉伯糖(L-Ara)生成L-阿拉伯糖-1-磷酸(Ara-1P)，其晶体结构首次揭示了阿拉伯糖激酶的底物结合特征。

GHMP糖激酶的关键模体位点

图S9展示了GHMP糖激酶的四个特征性结构模体。模体I（序列Pro⁴⁷-Gly-Arg-Leu-Asp-Val-Met-Gly⁵⁴）包含高度保守的Arg49，可与γ-磷酸基团和糖C1-羟基形成氢键。紧随其后的Gly55在AbGHMP、拟南芥ARA1和ARA2中均保守，该残基邻近L-Ara底物的C5部分，对阿拉伯糖激酶的选择性至关重要。在人半乳糖激酶中，对应位置的精氨酸残基通过空间位阻排斥L-Ara，而AbGHMP的甘氨酸则允许L-Ara结合。

结论

来自Acidobacteriota的AbGHMP被确认为阿拉伯糖激酶，能选择性磷酸化L-Ara生成Ara-1P。结构分析发现Gly55是决定L-Ara特异性的关键残基，Asp215和结合的Mg²⁺离子对催化活性至关重要。Myxococcales来源的MbUSP具有广谱底物耐受性（Glc-1P、Gal-1P、Ara-1P），通过结构引导的E446Y突变使其专一性转向Ara-1P。将AbGHMP与MbUSP-E446Y组合进行一锅法反应，能以97%的高收率实现UDP-Ara的两步酶法合成。