新型隐球菌基因敲除库保真度验证方法的建立及其在菌株混杂鉴定中的应用

这篇研究报道了在新型隐球菌（Cryptococcus neoformans）全基因组敲除（KO）库使用过程中发现的菌株混杂问题，通过RNA测序（RNAseq）和PCR技术鉴定出9个2015年KO库平板被2008年部分KO库平板替换。研究建立了基于诺尔丝菌素（NAT）抗性盒大小差异的快速验证方法，为微生物基因功能研究提供了重要的质控方案。

　　

ABSTRACT

基因敲除（KO）菌株库是微生物学研究的重要工具。人类真菌病原体新型隐球菌（Cryptococcus neoformans）拥有广泛使用的全基因组敲除库。研究发现实验室购买的约4,700株商业KO库中存在菌株混杂现象，RNAseq分析显示某些KO菌株仍存在目标基因转录本。进一步研究发现这些菌株实际缺失的是早期部分KO库中相同平板位置的基因，提示两个KO库间存在平板替换。通过比较诺尔丝菌素（NAT）抗性盒大小差异，开发了快速PCR鉴定方法，并经基因组测序证实。

IMPORTANCE

该研究揭示了KN99ɑ KO库中混合了两个独立KO库的平板，建立的简易验证方法可供其他研究者鉴别KO库身份。特别提醒使用2015年KO库的研究者在开展大规模表型实验前需进行平板筛查。

INTRODUCTION

微生物学研究中，全基因组基因敲除（KO）集合是快速筛选表型相关基因的重要工具。新型隐球菌已建立多个KO库，包括Madhani实验室构建的约4,700株全基因组KO库。第一代KO库使用减毒株H99W（含LMP1基因7bp插入突变），第二代则选用强毒株KN99α背景构建，分2015年（22板）、2016年（20板）和2020年（7板）三批。KO菌株通过同源重组将NAT抗性盒插入目标基因位点。

RESULTS

NAT抗性盒定位引物设计

通过设计两类引物验证NAT标记：通用型引物W2NC/W5NC可扩增所有KO菌株的NAT盒；位点特异性引物W2GC/W5GC可验证NAT盒是否正确插入目标基因位点。

基因组位点PCR验证

对13个基因的检测发现，5个"KO"菌株的PCR产物与野生型大小相同（如CNAG_04891），提示目标基因未被替换。而正确KO菌株（如CNAG_01047）则显示1,743bp的NAT盒特征条带。

NAT盒大小与KO缺失相关性

所有"假KO"菌株均含有约2kb的NAT盒（2008年KO库特征），而正确KO菌株为1,743bp（2015年KO库特征）。RNAseq和DNA测序证实，标记为CNAG_02179Δ的菌株实际缺失的是2008年库中相同平板位置的CNAG_03019基因。

平板替换证据

系统检测22个平板发现：2015年库的前14个平板中，第1-7、9、14号平板实际来自2008年KO库。例如4-A1孔应为CNAG_01019Δ，但测序显示其缺失的是2008年库对应的CNAG_04718基因。

DISCUSSION

该研究揭示了KO库使用中的潜在风险，建立的NAT盒大小比较法可快速筛查库间混杂。需注意2008年与2015年KO库的同源重组位点不同，建议使用1.5%琼脂糖凝胶分辨大小差异。研究团队已采取物理分隔库存储措施防止未来混淆。

MATERIALS AND METHODS

采用CTAB法提取基因组DNA，通过菌落PCR和微波裂解法快速验证。mRNA测序使用Trizol法提取RNA，建库后通过Illumina NovaSeq 6000平台测序，数据比对至CNA3基因组（GCF_000149245.1）。

该研究为微生物遗传学研究提供了重要的质控方案，强调使用社区共享资源时需保持审慎态度并通过独立方法验证关键发现。