原发性人呼吸道细胞气液界面培养模型中常见急性呼吸道病毒的长期复制潜力研究

这篇研究通过气液界面（ALI）培养系统，首次系统评估了14种常见呼吸道病毒（如HCoV、RSV、HPIV等）在原发性人呼吸道上皮细胞中的长期复制能力，发现多数病毒可持续复制100天以上并产生感染性子代病毒，揭示了免疫缺陷个体中病毒长期存留可能加速变异积累的潜在风险，为呼吸道病毒传播动力学和进化机制提供了重要实验依据。

　　

ABSTRACT

先前临床研究显示健康儿童中存在呼吸道病毒长期检出现象，但病毒在人体组织中的存活时长尚不明确。本研究采用原发性人呼吸道上皮细胞气液界面（ALI）培养模型，评估了常见呼吸道病毒的复制潜力。结果显示，除流感病毒和DNA病毒外，多数病毒可在ALI培养中平均复制约100天，部分甚至达150-200天。流感病毒和腺病毒因诱发细胞死亡而复制周期较短。值得注意的是，即使在复制晚期，部分样本仍能支持病毒再感染实验，表明病毒持续存活。缺乏免疫效应细胞的ALI培养体系在长期复制过程中未表现明显I型干扰素反应（仅早期短暂分泌IFNβ），形成允许病毒长期复制的耐受状态。基因分析发现，复制超过50-60天的病毒会出现遗传变异，提示长期感染可能增加变异风险。

Ongoing replication of common respiratory viruses

研究团队通过HBTEC-ALI（人支气管/气管上皮细胞）和HNEpC-ALI（人鼻上皮细胞）两种培养系统，对24株代表14个病毒种的临床分离株进行监测。实时RT-PCR数据显示：

• •

  冠状病毒（HCoV）平均复制>100天，其中HCoV-OC43、HKU1和hMPV-B2在HNEpC-ALI中可持续近200天

• •

  流感病毒（IAV/IBV）复制周期显著较短（HBTEC-ALI中18-27天，HNEpC-ALI中34-66天），而流感C病毒（ICV）复制时长与其它病毒相当

• •

  腺病毒（ADV）和人博卡病毒（HBoV1）复制周期为32-55天，但ADVB3在HNEpC-ALI中例外地达100天

• •

  鼻病毒（HRV）在HBTEC-ALI中表现最长复制期（146-151天）

Infectivity of long-cultured viruses

通过早期（7-11天）、中期（18-60天）和晚期（67-202天）三阶段再感染实验发现：

• •

  HCoV-OC43、HPIV4等病毒在晚期仍保持感染性

• •

  HCoV-NL63、HRV-C等病毒晚期感染性显著下降

• •

  RSV因融合蛋白热不稳定性导致分离率低，但冷冻样本仍能检测到活病毒

Type I interferon secretion

ELISA检测显示：

• •

  IFNα在所有病毒复制期间均接近检测限

• •

  RSV、流感病毒等诱导的IFNβ分泌仅出现在早期（HPIV3反应最显著）

• •

  冠状病毒和腺病毒全程未引发明显干扰素反应

Genetic stability

新一代测序（NGS）揭示：

• •

  50-60天成为变异积累的关键阈值，RSV OR371株在81天时出现100个突变

• •

  变异主要富集在表面蛋白和聚合酶编码基因

• •

  与SARS-CoV-2在免疫缺陷患者中的观察结果一致，提示长期感染可能驱动病毒进化

DISCUSSION

该研究突破性发现：

1. 1.

   呼吸道上皮细胞的缓慢更新周期（30-50天）为病毒长期驻留提供生理基础

2. 2.

   流感病毒因诱发细胞凋亡/坏死而复制周期缩短，鼻病毒则利用上皮稳定性实现持久感染

3. 3.

   ALI模型缺乏免疫细胞的特点，模拟了免疫缺陷个体的病毒-宿主互作状态

4. 4.

   50-60天的变异阈值与临床报道的SARS-CoV-2长期感染者突变规律高度吻合

这些发现为理解呼吸道病毒在人群中的持续传播、免疫缺陷患者作为"变异孵化器"的潜在风险提供了重要理论依据，同时提示需重点关注感染50天后的病毒遗传进化动态。