天冬氨酸通过增强质子动力势和膜通透性协同妥布霉素对抗多重耐药爱德华氏菌

本研究揭示了天冬氨酸（Asp）作为代谢重编程关键分子，通过激活丙酮酸循环提升质子动力势（PMF）并增强膜通透性，显著提高妥布霉素（TOB）在多重耐药（MDR）爱德华氏菌（E. tarda）中的胞内蓄积，突破耐药屏障。实验证实该组合对实验室进化株（LTB4-RTOB）和临床分离株（如WY28）均具强效杀菌作用，动物模型验证其治疗潜力，为耐药菌感染提供新型代谢干预策略。

　　

代谢特征揭示天冬氨酸的关键作用

通过动态代谢组学分析妥布霉素耐药爱德华氏菌（LTB4-R_TOB）的渐进耐药过程，发现随着最小抑菌浓度（MIC）升高，天冬氨酸成为下调最显著的生物标志物。在16×MIC耐药株（LTB4-R_TOB-16MIC）中，天冬氨酸水平较敏感株降低8.7倍。通路富集显示丙氨酸/天冬氨酸/谷氨酸代谢通路受抑最显著，正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）将其列为关键重编程代谢物。

天冬氨酸显著增强杀菌效率

体外实验证实4 mM天冬氨酸使妥布霉素对LTB4-R_TOB-16MIC的杀菌效率提升385倍，且该协同效应呈浓度和时间依赖性。临床分离的24株MDR E. tarda中，23株（除A918外）对天冬氨酸-妥布霉素组合敏感，其中10株杀菌效果增强183-1117倍。值得注意的是，该组合对持留菌和生物膜的清除率分别提高7.08倍和12.59倍。动物模型中，感染WY28的罗非鱼和小鼠经联合治疗后存活率分别达70%和50%，显著优于单药组。

代谢流分析揭示作用机制

天冬氨酸通过三条通路发挥作用：

1. 1.

   丙氨酸/天冬氨酸/谷氨酸代谢：恢复asnB、asnA等基因表达，提升腺苷酸琥珀酸合成酶（AMPSS）活性3.2倍；

2. 2.

   丙酮酸循环：激活gltA、sucD等基因，使苹果酸酶（maeB）活性增加2.8倍，促进NADH生成；

3. 3.

   甘氨酸/丝氨酸/苏氨酸代谢：上调sdaB基因表达，增强丝氨酸脱水酶活性。

下游代谢物实验显示，草酰乙酸和α-酮戊二酸等循环中间体可替代天冬氨酸增强妥布霉素活性，证实丙酮酸循环的核心地位。

双管齐下突破耐药屏障

质子动力势驱动：天冬氨酸使LTB4-R_TOB-16MIC的PMF提升2.3倍，NADH直接处理可模拟该效应，而质子载体CCCP可完全阻断。

膜通透性改变：流式细胞术显示天冬氨酸处理组荧光强度较耐药株提高4.5倍，临床菌株膜通透性平均增强3.2倍。二者协同使妥布霉素胞内浓度突破杀菌阈值，即使存在外排泵活性增强（V_e增加1.46倍）仍能维持8.72倍净积累。

延迟耐药进化的潜在价值

连续传代实验显示，天冬氨酸使LTB4和WY28的妥布霉素耐药进化速度分别降低4倍和3倍，MIC终值控制在25 μg/mL和6.25 μg/mL，显著低于单药组。该发现为耐药性管理提供了代谢干预新思路。

这项研究不仅阐明了代谢重编程克服耐药性的分子机制，更开创性地将实验室发现转化为临床前疗效验证，为应对水产养殖和公共卫生中的MDR E. tarda威胁提供了具转化潜力的解决方案。