Stereo-seq V2技术突破：实现FFPE样本高分辨率全转录组空间图谱绘制

本研究针对FFPE样本RNA降解严重、传统空间转录组技术兼容性差的问题，开发了基于随机引物的Stereo-seq V2技术。该技术通过优化捕获策略，在单细胞分辨率下实现FFPE样本全转录组空间图谱绘制，成功应用于结核感染微环境解析和肿瘤异质性研究，为临床样本回溯性研究和宿主-病原体互作机制探索提供了强大工具。

　　

在生物医学研究中，福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)样本因其易保存、成本低等优势构成全球最大的生物样本库。然而这些"时间胶囊"面临严峻挑战：甲醛交联导致核酸片段化，传统基于poly(A)捕获的空间转录组技术(ST)在FFPE样本上表现不佳。现有解决方案如Xenium等FISH技术仅能检测预设基因，而Visium等测序技术存在3'偏好性，难以全面解析FFPE样本中的非编码RNA(ncRNA)和病原体转录组。如何解锁这些珍贵样本的空间分子信息，成为制约临床回顾性研究和感染微环境解析的关键瓶颈。

针对这一挑战，由徐讯、廖莎等领衔的研究团队在《Cell》发表重大技术突破，开发出Stereo-seq V2空间转录组平台。该技术通过三大关键技术革新：1)采用6N随机引物替代poly(T)引物，实现FFPE样本全转录组无偏捕获；2)优化芯片设计保持500nm间距，兼具单细胞分辨率和厘米级视野；3)整合去石蜡化、再水化和解交联步骤，兼容DV200低至18的降解样本。研究团队运用该技术系统分析了小鼠脑组织、三阴性乳腺癌(TNBC)和结核分枝杆菌(Mtb)感染样本，通过空间聚类、拷贝数变异(inferCNV)和可变剪接(rMATS)等分析方法，揭示了FFPE样本中前所未有的空间分子特征。

Stereo-seq V2的技术升级

相比V1版本，V2在FFPE样本处理流程中新增去石蜡化、再水化和解交联步骤。最具革新性的是采用随机引物捕获策略，其末端的6N序列同时作为唯一分子标识符(UMI)。与poly(T)捕获技术相比，V2显著提高intronic reads捕获效率，且reads均匀覆盖基因全长，不受GC含量影响。在小鼠脑组织实验中，V2检测到44,773个基因，比V1多发现14,643个基因，包括3,895个ncRNA。特别值得注意的是，V2将分子扩散距离(LWHM)降低50%，空间分辨率显著提升。

FFPE样本全转录组分析

在10例保存9年以上的TNBC样本测试中，Stereo-seq V2展现出惊人的稳定性——即使DV200=18的样本仍能获得16.85 ng/mm²的cDNA产量。通过空间inferCNV分析，在样本T202301978中鉴定出两个肿瘤亚型，其中亚型2在6q24-6q25区段存在ESR1基因座扩增。全基因覆盖特性还支持可变剪接(AS)分析，发现肿瘤区域特异性存在ZNF226内含子保留(RI)和GIPC1外显子跳跃(SE)事件，这些事件可能参与肿瘤进展调控。

宿主-病原体共分析

在Mtb感染小鼠模型中，Stereo-seq V2实现宿主与病原体转录组同步解析。通过Hotspot算法鉴定出感染相关基因模块：4周时富集炎症反应和铁死亡通路基因，8周时出现适应性免疫应答基因。空间分析显示，感染区域周边B细胞受体(BCR)克隆多样性增加，且突变频率随距离递减，提示抗体亲和力成熟的空间梯度。

空间免疫组库解析

随机引物的5'覆盖优势使V2能高效捕获BCR可变区(V区)。在8周感染样本中组装出1,736个BCR克隆，发现IGK克隆在感染核心区突变频率显著升高。人类结核肺样本分析进一步验证该发现，鉴定出16个跨患者共享克隆，其中包含与公共数据库(GSE107995)匹配的保护性抗体克隆。

这项研究标志着空间组学技术的重大飞跃，Stereo-seq V2首次实现FFPE样本单细胞分辨率全转录组分析。其随机引物设计不仅提高ncRNA捕获效率，更开创性地支持空间免疫组库研究。该技术为临床样本回溯性研究、感染微环境解析和肿瘤异质性研究开辟新途径，特别是对结核病等慢性感染研究具有重要价值。未来通过整合长读长测序等技术，有望进一步揭示FFPE样本中隐藏的空间分子奥秘。