基于LC-MS多属性方法的腺相关病毒修饰位点定量分析技术开发与验证

本研究针对腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白修饰影响转导效率的关键问题，开发了基于液相色谱-质谱(LC-MS)的多属性方法(MAM)，实现了对N57/N94/N452等关键脱酰胺位点的精准定量。研究人员通过ICH Q2(R2)验证证实该方法具有优异精密度(RSD≤5%)和准确性(90-120%)，成功应用于工艺开发、稳定性研究和可比性评估，为AAV基因治疗产品的质量控制提供了新工具。该成果发表于《Molecular Therapy Methods & Clinical Development》，首次将MAM技术系统应用于病毒载体分析领域。

　　

基因治疗领域近年来取得突破性进展，其中腺相关病毒(AAV)因其安全性高、长期表达等特点成为最常用的基因递送载体。然而在AAV生产储存过程中，衣壳蛋白易发生脱酰胺(deamidation)、氧化等翻译后修饰，特别是Asn⁵⁷、Asn⁹⁴等位点的修饰会显著降低病毒转导效率。传统分析方法难以同时监测多个关键质量属性，这成为制约AAV产品工艺优化和质量控制的瓶颈问题。

为解决这一技术难题，Pfizer公司的Thomas W. Powers团队在《Molecular Therapy Methods & Clinical Development》发表研究论文，首次将多属性方法(Multi-Attribute Method, MAM)应用于AAV产品的系统分析。该方法通过液相色谱-质谱(LC-MS/MS)联用技术，实现了对衣壳蛋白VP1/VP2/VP3多种修饰的同步监测。研究人员首先通过热加速实验鉴定出N57、N94、N452等关键脱酰胺位点，随后建立并验证了特异性定量方法。

关键技术方法包括：1)采用Trypsin/Lys-C混合酶解提高AAV衣壳的消化效率；2)开发基于Orbitrap高分辨质谱的EIC(提取离子色谱)定量算法；3)通过ICH Q2(R2)指南完成方法验证；4)应用三批AAV9临床样品进行工艺开发和可比性研究。所有实验均使用HEK293细胞生产的重组AAV9病毒载体。

LC-MS/MS characterization of peptides from an rAAV9 product

通过还原性Trypsin/Lys-C酶解和LC-MS/MS分析，实现了VP1/VP2/VP3 99%以上的序列覆盖度。热加速实验(25°C/4周)发现Asp⁴异构化、Asn^57/94/452脱酰胺等6种修饰显著增加，其中N57脱酰胺从10.7%升至48.2%，证实这些位点具有稳定性指示作用。

Generation of an MAM method for select PQA monitoring

针对与转导效率直接相关的N57/N94/N452位点，开发了自动化MAM定量流程。方法验证显示：在3.1-48.7%范围内线性优异(R²=1.00)，重复性RSD≤5%，中间精密度RSD<10%，样品在-60°C可稳定保存7天。系统适用性测试确立了TIC信号、质量精度等关键参数。

Implementation of the MAM procedure on forced degradation and stability studies

长期(-70°C)和加速(2-8°C)稳定性研究表明脱酰胺水平保持稳定，而强制降解(25°C)条件下N57脱酰胺与相对 potency呈负相关。这证实MAM可作为稳定性指示方法，弥补传统 potency检测周期长、变异大的不足。

Implementation of the MAM procedure for process development and comparability studies

工艺研究发现AEX稀释步骤会显著增加脱酰胺(所有位点>10%)，为工艺优化提供关键参数。在7批工艺变更前后样品的可比性研究中，MAM证实新产品质量属性保持一致。

该研究首次将MAM技术成功应用于AAV载体分析，建立了可同时监测多个关键质量属性的标准化方法。通过验证的方法具有高精度、高稳定性等特点，不仅能支持工艺开发和质量控制，其检测结果还与病毒转导效率具有相关性，为建立"质量源于设计"(QbD)的AAV生产工艺奠定了基础。该方法的应用范围可进一步扩展至氧化、异构化等其他修饰的监测，为基因治疗产品的全面表征提供了新范式。