基于LC-MS技术的AAV衣壳蛋白定量与宿主细胞蛋白分析新方法开发及其在基因治疗质量控制中的应用

本研究针对重组腺相关病毒(rAAV)载体在基因治疗中面临的衣壳蛋白(VP1/VP2/VP3)定量不精确、化学计量比变异影响感染性等问题，开发了基于质谱(LC-MS/MS)的标准化检测方法。通过稳定同位素稀释(SID)技术精确测定rAAV9衣壳蛋白化学计量比为1:5.5:7.3，显著偏离传统1:1:10假设，同时鉴定出100种宿主细胞蛋白(HCPs)。该研究为基因治疗产品质控提供了高精度参考方法，发表于《Molecular Therapy: Methods & Clinical Development》。

　　

在基因治疗领域，重组腺相关病毒(rAAV)载体因其安全性高、长期表达等优势成为明星递送工具。然而这些微小载体却暗藏质量控制难题——由相同基因编码的三个衣壳蛋白VP1、VP2和VP3以特定比例组装成二十面体结构，传统认为其化学计量比为1:1:10。但近年研究发现，这个"黄金比例"并非铁律，实际比例波动会显著影响病毒载体的感染效率。更棘手的是，生产过程中残留的宿主细胞蛋白(HCPs)可能引发免疫反应，而现有ELISA和电泳等方法既无法精确测定蛋白比例，也难以全面鉴定杂质蛋白。这些"看不见的差异"正成为制约基因治疗产品批次一致性和安全性的关键瓶颈。

为突破这一技术壁垒，来自英国肯特大学和LGC国家测量实验室的Julian Braybrook与C. Mark Smales团队在《Molecular Therapy: Methods & Clinical Development》发表重要成果。研究人员采用高分辨质谱技术，建立了首个可溯源至国际单位制(SI)的rAAV衣壳蛋白定量参考方法。通过氨基酸分析确定标准品浓度，结合稳定同位素标记肽段，实现了VP1、VP2、VP3的绝对定量。同时利用肽图分析和完整蛋白质谱，系统鉴定了衣壳蛋白的翻译后修饰(PTM)位点，并对宿主细胞蛋白污染物进行全景式扫描。

关键技术包括：1)采用Orbitrap高分辨质谱进行完整蛋白质量分析和肽段序列覆盖度检测；2)建立基于Glu-C蛋白酶消化的特征肽段选择策略；3)开发三重四极杆质谱的MRM(多反应监测)定量方法；4)应用稳定同位素稀释技术确保测量溯源性；5)通过氨基酸分析校准标准品浓度。研究使用的rAAV9样本由VectorBuilder商业生产，rAAV8样本由伦敦大学学院馈赠并在HEK293T细胞中制备。

【Measurement of the intact masses of the rAAV capsid proteins with LC-MS for serotype identification】

通过高分辨质谱测定完整衣壳蛋白质量，成功鉴定rAAV8和rAAV9中VP1(81,290 Da/81,670 Da)、VP2(66,210 Da/66,520 Da)及VP3(59,730 Da/59,800 Da)的精确分子量。发现N端甲硫氨酸缺失和丙氨酸乙酰化等保守修饰，为后续定量建立质量基准。

【MS peptide mapping and sequence coverage analysis of the rAAV VP proteins】

联合Glu-C与胰蛋白酶消化，实现VP1-3高达88.6%的序列覆盖度。确认rAAV9中VP3起始于第204位氨基酸，且N端存在乙酰化修饰，这些发现与文献报道的翻译后加工机制相符。

【Detection of PTMs by MS analysis: Deamidation and oxidation】

定位到6个关键脱酰胺位点，包括rAAV9的N254、N303/304和N512。这些易发生天冬酰胺转化的"热点"为稳定性评估提供质量标志物，同时指导定量肽段的合理避选。

【Identification of peptides from each capsid protein suitable for determination of rAAV9 VP capsid stoichiometry】

创新性设计VP1u(独特肽段)、VP3u和VPc(公共肽段)的定量策略。尽管VP2独特肽段未能检出，但通过"总量减量法"计算出VP2含量，方法学验证显示VP2的批间变异仅3.3%。

【MS quantification of the VP1u, VP3u, and VPc peptides from rAAV9 samples】

突破性测得rAAV9实际化学计量比为1:5.5:7.3，显著偏离经典理论值。总衣壳定量结果(9.71×10⁹ capsids/μL)与ELISA差异达39.3%，揭示传统免疫分析法可能高估有效颗粒数。

【Identification of host cell proteins in the rAAV8 samples by MS analysis】

在rAAV8中鉴定出100种HCPs，其中24种与既往研究重合，包括热休克蛋白70家族、核仁蛋白等。这些"顽固性杂质"主要参与DNA包装、染色质重塑等过程，提示其可能与载体组装存在功能关联。

这项研究建立了基因治疗领域的"蛋白质秤"——首次实现rAAV衣壳蛋白的SI单位溯源定量，为行业提供了超越ELISA的"金标准"方法。所发现的1:5.5:7.3非经典化学计量比革新了人们对AAV组装机制的认识，特别是VP2过量表达现象可能解释某些批次产品的效价差异。质谱技术展现的强大解析力不仅可监控关键质量属性(如脱酰胺)，还能绘制HCP"污染图谱"，这些数据为优化纯化工艺提供了明确靶点。随着该方法推广至其他血清型，将显著提升基因治疗产品的批次一致性和安全性评估水平，加速从实验室到临床的转化进程。