Prp22介导的外显子连接与mRNA释放新机制：ATP依赖与非依赖功能的协同调控

本研究揭示了DExD/H-box RNA解旋酶Prp22在pre-mRNA剪接中的双重功能：通过稳定Slu7与剪接体的结合促进野生型和突变型pre-mRNA的外显子连接（ATP非依赖），同时通过ATP水解介导mRNA释放（ATP依赖）。研究发现Prp22与Cwc22共同保留在释放的mRNA上，挑战了传统的"牵引"模型，为剪接体重塑和mRNA质量控制机制提供了新见解。

　　

在真核生物基因表达过程中，pre-mRNA剪接是一个高度精确的分子舞蹈，需要剪接体（spliceosome）这个动态核糖核蛋白复合物的精密调控。其中DExD/H-box RNA解旋酶家族成员如同舞台导演，通过ATP水解驱动剪接体的构象变化。然而长期以来，Prp22被认为仅通过ATP水解活性发挥两个功能：在第二步剪接反应后释放成熟mRNA，以及通过"校对"机制阻止3'剪接位点(3'SS)突变pre-mRNA的错误连接。这种看似矛盾的双重功能机制一直未得到合理解释。

台湾中央研究院分子生物研究所Che-Sheng Chung团队在《Nucleic Acids Research》发表的研究，通过系统的酵母遗传学分析和生化实验，颠覆了这一传统认知。研究发现Prp22实际上通过ATP非依赖的方式稳定Slu7与剪接体的结合，促进而非抑制突变pre-mRNA的外显子连接。更令人惊讶的是，释放的mRNA上仍保留着Prp22和Cwc22，这一发现对理解mRNA释放机制具有重要意义。

研究主要采用以下关键技术：1) 酵母菌株构建（包括BJ2168、YSCC227等基因修饰菌株）；2) 体外剪接实验系统（使用ACT1、RPL23A等pre-mRNA底物）；3) 免疫共沉淀与免疫去除技术（采用抗Prp22、抗Slu7等抗体）；4) 紫外交联分析（检测Prp8、Cwc22等蛋白与RNA的相互作用）；5) 高通量测序（分析突变pre-mRNA的异常3'SS选择）；6) 蛋白质印迹分析（追踪剪接因子动态）。

Prp22促进3'SS突变pre-mRNA的异常外显子连接

通过使用3'SS突变体ACAC pre-mRNA（AGAG→ACAC），研究发现ATP消耗可促进外显子连接，而Prp22去除则显著抑制该反应。RNA-seq分析显示突变pre-mRNA会使用多种异常3'SS（如UG和AC），且Prp22对这一过程至关重要。这与传统认为Prp22通过ATP水解阻止错误剪接的观点相矛盾。

ATP结合（非水解）抑制外显子连接

实验证明非水解ATP类似物（ATPγS、AMP-PNP）同样能抑制外显子连接，表明ATP结合本身即可诱导Prp22构象变化，进而抑制剪接。这种调控不依赖于Slu7的释放，因为免疫沉淀显示Slu7在ATP存在下仍与剪接体稳定结合。

Prp22与mRNA共释放的发现

通过Prp22耗竭实验发现，mRNA释放后Prp22和Cwc22仍与其结合，而Slu7-Prpl8则独立解离。这一现象在野生型和突变型pre-mRNA中均存在，挑战了Prp22通过"牵引"机制提取mRNA的传统模型。

Prp22稳定Slu7促进剪接的分子机制

研究表明Prp22通过稳定Slu7与Prp8的相互作用促进外显子连接。在Prp22存在下，野生型pre-mRNA的剪接速率提高50%。冷冻电镜结构分析显示Slu7通过多个突起与Prp8结构域（N、Endo、RH）相互作用，可能维持Prp8结构刚性以正确定位剪接位点。

Cwc22作为mRNA伴侣的新角色

紫外交联实验证实Cwc22与5'外显子特异性结合，并在mRNA释放后仍保持关联。这与人类Cwc22作为外显子连接复合体(EJC)适配器的功能相呼应，暗示其在mRNA质量控制中的保守作用。

这项研究重新定义了Prp22在pre-mRNA剪接中的功能范式：一方面通过ATP非依赖方式稳定Slu7-Prpl8复合物促进外显子连接（包括异常3'SS的选择），另一方面通过ATP水解驱动mRNA释放。提出的"结构域界面开放"模型认为Prp22通过破坏Prp8结构域间相互作用（而非直接牵引RNA）实现mRNA释放，这一机制可能普遍适用于DEAH-box解旋酶家族。研究还揭示了Cwc22在mRNA命运调控中的潜在作用，为理解剪接与转录后调控的偶联提供了新视角。这些发现不仅修正了教科书中的经典理论，也为遗传性疾病中剪接异常的治疗策略开发提供了分子基础。