SETD6介导RAD18甲基化调控DNA损伤修复的新机制及其在基因组稳定性维持中的作用

本研究揭示了SETD6甲基转移酶通过甲基化DNA损伤修复关键蛋白RAD18（K73/K406位点）调控其核质定位的新机制。研究人员利用M-NAPPA蛋白质芯片技术筛选互作蛋白，结合放射性甲基化实验和质谱分析，发现SETD6缺失导致RAD18核积累增加，伴随γH2AX水平升高和DNA断裂加剧。该发现为理解表观遗传修饰调控DNA损伤应答（DDR）提供了新视角，对肿瘤发生和基因组稳定性研究具有重要意义。

　　

在细胞生命活动中，DNA损伤如同潜伏的"定时炸弹"，而RAD18作为DNA损伤修复（DDR）通路中的关键蛋白，其功能调控机制一直是科学家们关注的焦点。这项发表在《Scientific Reports》的研究首次揭示了SETD6甲基转移酶通过修饰RAD18调控基因组稳定性的全新机制，为理解表观遗传修饰如何影响DNA修复提供了重要线索。

研究团队采用M-NAPPA蛋白质芯片技术进行高通量筛选，发现SETD6与RAD18存在直接相互作用。通过ELISA和免疫共沉淀（IP）验证后，放射性甲基化实验结合质谱分析锁定K73和K406为关键甲基化位点。值得注意的是，SETD6敲除（KO）细胞中RAD18核定位显著增加，伴随γH2AX（DNA损伤标志物）水平升高，中性彗星实验（Comet Assay）证实DNA断裂增加。而回补野生型SETD6可逆转该表型，催化失活突变体（Y285A）则无效，证明SETD6的酶活依赖性。

主要技术方法

研究采用M-NAPPA蛋白质芯片筛选互作蛋白；通过ELISA和免疫共沉淀验证SETD6-RAD18互作；利用放射性甲基化实验和质谱鉴定甲基化位点；采用CRISPR/Cas9构建SETD6 KO细胞系；通过免疫荧光和彗星实验分析DNA损伤；使用位点定向突变构建RAD18甲基化缺陷突变体（K73R/K406R）。

SETD6 binds and methylates RAD18

蛋白质芯片筛选发现77个SETD6潜在互作蛋白，其中RAD18经ELISA和IP验证为直接互作伙伴。体外甲基化实验显示SETD6可催化RAD18甲基化，质谱鉴定出K73和K406两个单甲基化位点。甲基化缺陷突变体实验证实这两个位点的协同作用。

RAD18 methylation restricts its nuclear accumulation

免疫荧光显示SETD6 KO细胞中内源性RAD18核积累增加。过表达甲基化缺陷突变体（K73R/K406R）相比野生型更易入核，提示甲基化状态调控RAD18核质穿梭。

RAD18 methylation is linked to DNA damage accumulation

SETD6 KO细胞呈现自发γH2AX信号增强，彗星实验显示DNA断裂增加。回补实验证明该表型依赖SETD6酶活，且RAD18甲基化缺陷突变体过表达会加剧DNA损伤。

讨论与意义

该研究首次揭示RAD18作为SETD6底物的生物学意义：甲基化修饰通过限制RAD18核定位来维持基因组稳定性。值得注意的是，K73邻近RING结构域（影响二聚化），K406靠近Polη结合域，暗示甲基化可能协同调控泛素化与跨损伤合成（TLS）。研究为理解DDR中表观遗传调控网络提供了新视角，其发现的多层次调控机制（甲基化-定位-损伤应答）为肿瘤治疗靶点开发提供了新思路。Lital Estrella Weil等的工作将SETD6研究领域从炎症、氧化应激拓展至DNA修复，为后续探索甲基化与其他翻译后修饰（如磷酸化、泛素化）的crosstalk奠定基础。