单细胞转录组与微阵列整合分析揭示小鼠精原干细胞中Kit与Nmyc的协同调控机制及其在精子发生中的关键作用

本研究通过CD49f-MACS分选和基质选择技术分离小鼠精原干细胞（SSCs），结合微阵列、单细胞RNA测序（scRNA-seq）和蛋白质互作网络（PPI）分析，系统揭示了Kit受体与Nmyc基因在SSCs分化中的核心调控作用。研究发现Kit通过视黄酸（RA）信号通路驱动精原细胞分化，并与多能性基因Nanog、Dazl、Pou5f1（Oct4）形成共表达网络，为男性不育治疗提供了新靶点。研究还利用加权基因共表达分析（WGCNA）和功能富集技术解析了干细胞维持相关通路（如Wnt、PI3K/AKT）。

　　

小鼠精原干细胞的选择与培养

通过CD49f-MACS和胶原非结合/层粘连蛋白结合基质筛选技术，研究者从7周龄C57BL/6小鼠睾丸中分离出精原干细胞（SSCs）。免疫细胞化学检测显示，筛选后的细胞高表达Dazl、Pou5f1（Oct4）、Gfra1和Nanog等标志物，证实其未分化特性。电子显微镜观察发现，这些细胞直径约6-12 μm，核质比高，呈典型球形，并通过细胞间桥形成链状或簇状结构。值得注意的是，培养体系中较大的卵圆形细胞（12-14 μm）可能代表分化中的精原细胞。

干细胞PPI网络与功能富集分析

通过STRING数据库构建的蛋白质互作网络包含50个节点和236条边，其中Kit（红色节点）与Nmyc、Nanog等核心干细胞因子显著关联。子网络分析揭示Kit与Nmyc存在126个共同互作蛋白，主要富集于胚胎发育（GO:0009790）、干细胞群体维持（GO:0019827）等生物学过程。KEGG通路分析显示，这些基因显著参与干细胞多能性调控网络，包括Wnt信号和PI3K-AKT通路。组织定位分析进一步表明，靶基因在胚胎干细胞、胚泡和精原细胞中活跃表达。

基因共表达模块与信号通路解析

WGCNA分析鉴定出5个功能模块，其中棕色模块与正常睾丸组织相关性最高（r=0.68，p=8×10^-51）。差异表达基因（DEGs）分析发现，Kit相关基因在分化精原细胞中显著上调，与RA信号激活同步。单细胞转录组数据（GSE211115）显示，Kit在新生儿睾丸中的表达量较胚胎期降低，但在分化精原细胞（diff SPG）中仍保持高水平，而Nmyc则在未分化精原细胞（Undiff SPG）中特异性高表达。Fluidigm微流控qPCR证实，随着传代次数增加，Nanog表达上升而Kit表达下降，提示培养条件影响干细胞状态。

Kit-Nmyc协同调控机制

基因共表达分析揭示Kit与Nmyc（R=0.91）、Dazl（R=0.89）、Nanog（R=0.85）和Pou5f1（R=0.82）存在强正相关。配体-受体互作分析发现，Kitl（由支持细胞分泌）通过激活Kit受体调控四条下游通路：1）PI3K/AKT通路促进细胞存活；2）SRC家族激酶调控细胞迁移；3）PLCG通路重启减数分裂；4）MAPK级联反应介导基因转录。值得注意的是，组成型激活Kit突变小鼠表现为圆形精子向长形精子转化障碍，证实其在减数分裂后期的关键作用。

讨论与展望

该研究首次整合微阵列、scRNA-seq和PPI网络，阐明Kit-Nmyc轴通过RA信号协调精原细胞命运决定的分子机制。近期研究补充发现，CHD4通过调控Kit翻译抑制维持SSCs干性，而3D类器官培养体系可更好地模拟体内微环境。未来需结合基因编辑（如CRISPR-Cas9）和移植实验验证这些靶点的治疗潜力，特别是在非梗阻性无精症中的应用。多组学技术的融合（如scATAC-seq与空间转录组）将有助于解析SSCs异质性，推动体外配子发生技术的发展。