乌拉圭莲花品种酚类成分表征与分类：基于LC-HRMS指纹图谱与化学计量学的多组学研究

本研究采用超高效液相色谱-高分辨质谱（UHPLC-HRMS）非靶向代谢组学技术，结合主成分分析（PCA）和偏最小二乘判别分析（PLS-DA），成功建立乌拉圭10个莲花（Lotus）栽培品种（含5个L. corniculatus、3个L. uliginosus及2个杂交种）的化学指纹分类模型。研究揭示缩合单宁（CT）等105种酚类化合物在种间分型中的关键作用，为牧草品质改良和植物育种提供新型代谢标记物。

　　

LC-HRMS指纹图谱与化学计量学在乌拉圭莲花品种酚类成分研究中的应用

1 引言

莲花属（Lotus）作为豆科重要成员，包含180余个具有显著生态适应性的物种。该属植物最突出的特征是富含缩合单宁（CT），这类次生代谢物在反刍动物营养中具有防止臌胀病、抗寄生虫、提升氮利用效率及减少温室气体排放等多重功效。传统研究多局限于总酚、总单宁等非特异性检测，而本研究首次采用UHPLC-HRMS非靶向代谢组学技术，结合化学计量学方法，对乌拉圭主栽的10个莲花品种（含5个L. corniculatus、3个L. uliginosus及2个种间杂交种）进行系统表征。

2 材料与方法

2.1 植物材料与样品处理

样本来自乌拉圭农业研究所（INIA）的Tacuarembó试验站，涵盖2016-2018年间三个生长季的100份样品。采用70%丙酮水溶液超声提取，经二氯甲烷脱脂后冻干保存。分析前用0.1%甲酸水-乙腈（50:50）复溶，并设置质控（QC）样本监控系统稳定性。

2.2 UHPLC-HRMS分析方法

采用Kinetex? C18色谱柱（100×4.6 mm, 2.6 μm），以0.1%甲酸水-乙腈梯度洗脱。高分辨质谱在负离子模式下运行，扫描范围m/z 100-1500，分辨率60,000 FWHM。数据依赖采集模式（DDA）同步获取MS/MS碎片信息。

2.3 数据处理

通过MZmine-2.53软件提取1929个离子特征，经5 ppm质量容差和1 min保留时间容差对齐。采用SOLO 8.6软件进行PCA和PLS-DA建模，通过变量重要性投影（VIP>1.5）筛选标志物。化合物鉴定基于精确质量（误差<5 ppm）、同位素分布及MS/MS谱图。

3 结果

3.1 化学指纹特征

总离子流图（TIC）显示不同品种间存在显著差异。L. uliginosus品种INIA E-Tanin与杂交种G1 Bulk 15呈现相似色谱模式，而L. corniculatus品种San Gabriel与杂交种G5 Bulk 15聚为另一簇，暗示母本遗传优势。

3.2 多变量分析

四分类模型（2个物种+2个杂交种）采用6个潜变量（LV）即实现100%分类准确率。种内分析显示，L. uliginosus三个品种完全可分，而L. corniculatus中遗传背景相近的INIA Rigel（INIA Draco衍生系）与LE304-C1 Bulk 14（LE304衍生系）存在34%误判率。

3.3 标志物鉴定

热图分析揭示23个关键差异物：L. uliginosus组富含原花青素B型二聚体（m/z 577.1328）和山奈酚-己糖苷（m/z 695.1456），而L. corniculatus组特征性成分为咖啡酰奎宁酸异构体（m/z 353.0874）和槲皮素-C-糖苷（m/z 593.1516）。

3.4 酚类成分鉴定

共鉴定105种化合物，包括：

• 37种有机酸：如原儿茶酸衍生物（m/z 285.0614）和三种绿原酸异构体（3-/4-/5-CQA）

• 4种黄烷-3-醇：表儿茶素（m/z 289.0718）及其糖苷（m/z 451.1238）

• 27种黄酮醇苷：含山奈酚三糖苷（m/z 809.2133）和槲皮素鼠李糖苷（m/z 593.1516）

• 12种原花青素：包括表没食子儿茶素三聚体（m/z 913.1818）

4 讨论

种间杂交实验显示显著的母体效应：以L. uliginosus为母本的G1 Bulk 15在表型和代谢谱上均接近母本，而反交组合G5 Bulk 15则继承L. corniculatus特征。缩合单宁在种间区分中起决定性作用，但种内变异主要源于黄酮醇苷的糖基化差异。值得注意的是，阿魏酰奎宁酸（m/z 367.1028）等羟基肉桂酸衍生物在乌拉圭品种中首次报道。

5 结论

本研究建立的LC-HRMS指纹图谱结合化学计量学策略，为莲花属植物育种提供了高效分类工具。发现的种特异性酚类标志物不仅可用于品种鉴定，更为开发具有优化缩合单宁含量的新型牧草品种奠定理论基础。该方法学框架可扩展应用于其他药用植物资源评价。