厘米级自组装肌腱类器官驱动组织再生：突破性策略在再生医学中的应用

本研究通过优化化学信号和模拟肌腱细胞外基质(ECM)，首次成功构建了超过3厘米的人类组织尺度肌腱类器官。该体系具有高细胞活力、增殖能力和肌腱表型，显著增强ECM产生和自我组装能力，在单细胞水平实现精确的肌腱特异性谱系分化，并保留胎儿肌腱的再生特性。动物实验显示类器官移植后干细胞保留率提高7.9倍，形成具有增强机械性能的致密修复肌腱。

　　

【引言】

干细胞工程器官模型在再生医学领域展现出巨大潜力。肌腱作为细胞成分相对简单的组织，是构建大规模干细胞类器官的理想模型。肌腱干/祖细胞(TSPCs)具有多能性、自我更新能力和肌腱表型，是肌腱形成和再生的理想种子细胞。然而，传统血清培养基可能导致细胞功能下降，且现有类器官与人体组织存在显著尺寸差异。本研究通过优化化学信号和模拟肌腱ECM，开发了厘米级肌腱类器官构建策略。

【结果】

【2.1 定制培养条件下肌腱类器官的设计与构建】

研究团队开发了基于3D微球(MSs)和生化培养条件的高效肌腱类器官构建策略。明胶组成的3D MSs具有10-30 μm的互连微孔排列，直径接近200 μm，为细胞粘附和增殖提供了广阔空间。活/死细胞染色显示TSPCs在MSs中具有良好的活性和增殖能力。从第3天到第14天，类器官组TSPCs的增殖持续超过传统2D培养组，细胞扩增达到8.29倍，而2D TSPC组仅扩增3.29倍。透射电镜(TEM)显示类器官组胶原纤维组装能力显著增强。

【2.2 TSPC聚集形成的厘米级微组织评估】

培养4天后，TSPCs开始凝聚成相互聚集的结构，21天后主轴超过2厘米。层粘连蛋白B(Lamin B)表达持续显著增加，在整个肌腱形成过程中阳性率超过95%，表明TSPCs能保留年轻特性和干性。肌腱相关标志物COL3、EGR1和MKX在类器官中呈现显著表达。光片显微镜显示COL1和COL3在整个肌腱类器官中高表达。

【2.3 肌腱类器官展现多能性和抗衰老特性】

3D类器官中的TSPCs保持了CD105⁺、CD90⁺和CD44⁺的表面标志物特征。类器官显示出显著增强的肌腱生成、成骨和软骨形成能力。体外传代至第8代时，类器官表现出β-半乳糖苷酶(β-gal)表达显著降低，年轻相关标志物(Ki67、Lamin B)和TSPCs相关标志物(Nestin)表达显著增加。qPCR进一步证实类器官中肌腱和再生标志物(SCX、THBS4、BGN、EYA2、TNMD和Ki67)表达更高。

【2.4 转录组分析揭示TSPC来源类器官的强肌腱分化能力】

批量RNA测序分析显示，类器官组样本聚集在一起，与TSPC对照组明显分离。类器官组中肌腱生成和增殖相关生物标志物(如TPPP3、EGR1、FOS和NES)上调，而与肌腱异位骨化相关的软骨标志物(如ACAN和SOX9)和降解标志物(如MMPs和ADAMTS)显著降低。Western blot分析证实肌腱标志物MKX、年轻化标志物LAMINB和TSPC标志物NES在类器官组中显著上调。

【2.5 类器官展示优异的肌腱成熟度并实现肌腱特异性谱系体外分化】

单细胞RNA测序(scRNA-seq)将细胞分为8个不同簇。类器官来源的TSPCs在肌腱细胞(簇0)和肌腱母细胞(簇2)中表现出显著富集。类器官组中肌腱特异性标志物SCX的表达显著高于2D培养和3D MS培养组。细胞追踪分析显示，类器官来源的肌腱细胞簇表现出最低的分化潜能，反映了与体内肌腱分化过程密切相关的终末分化状态和最高成熟度。

【2.6 单细胞转录组分析定位类器官组为体外培养细胞与天然肌腱组织间的中间状态】

整合单细胞RNA测序分析揭示了类器官与天然肌腱组织间的分子相似性。类器官包含多个成熟肌腱相关亚群，包括与成人肌腱组织非常相似的成熟肌腱细胞簇(肌腱细胞_1)，以及与胎儿肌腱高度相似的增殖亚群。类器官的整体干细胞特征低于2D和3D培养的TSPCs，略高于胎儿肌腱，明显高于成人肌腱。

【2.7 肌腱类器官通过富集ECM组分增强自组装】

GO分析显示，肌腱类器官中干细胞相关通路和ECM相关通路(细胞外基质组织)被激活。与ECM沉积和胶原形成相关的关键生物标志物(如ECM1、COL6A1、COL10A1和FOS)在类器官中上调，而与肌腱纤维化相关的基质降解标志物(如MMP9、ADAMTS1和ADAMTS2)显著降低。ROCK抑制剂处理导致细胞形态显著扩散，细胞面积和体积显著增大，核质比和球形度降低。

【2.8 TSPCs类器官增强移植干细胞的保留并促进快速组织再生】

移植实验显示，类器官组在移植后2周干细胞保留效率比临床级生物材料(纤维蛋白凝胶)组高3.44倍，4周后显著提高5.10倍。在大鼠髌腱修复模型中，类器官组修复肌腱显示密集排列，无明显炎症或肿胀。TEM显示类器官组胶原纤维更大、更密集、排列更好。4周后，类器官组呈现与拉伸载荷方向一致的纺锤形细胞密集分布，炎症减少。机械强度测试显示类器官组在损伤区的力和应力水平显著更高。

【讨论与结论】

本研究首次成功构建了厘米级肌腱类器官，在体外显著促进了TSPCs的增殖、分化能力和年轻化特性。通过有效平衡TSPCs的增殖和分化诱导，该方法不仅促进了实质细胞的扩增，还诱导了细胞外基质的沉积，最终促进了类器官自组装成微组织。类器官在体内应用中显示出移植后保留率的显著提高，以及损伤肌腱结构和功能的再生。这种创新方法为未来肌腱组织工程和再生领域的应用带来了广阔前景。