工程化益生菌驱动的微棒机器人实现血栓穿透性爆破治疗

这篇研究创新性地开发了一种工程化益生菌(SrEcNPL)驱动的微棒机器人，通过将溶栓碳纳米管(SW-rt-PA)与血小板膜包裹的血管扩张剂纳米颗粒(PMV(L-Arg))功能化，结合益生菌自主运动能力与血小板膜靶向性，实现快速精准的溶栓药物递送。该机器人可穿透血栓组织，延长rt-PA生物半衰期约332倍，并抑制继发血栓形成，为治疗时间窗狭窄的血栓性疾病提供新策略。

　　

1 引言

血栓性疾病是心脑血管疾病的主要病理基础，但现有溶栓药物存在治疗窗窄、靶向性差和半衰期短等问题。本研究提出基于非致病性大肠杆菌Nissle 1917(EcN)构建的工程化微棒机器人系统，通过其天然杆状结构和自主运动能力，结合血小板膜(PMV)的靶向功能与碳纳米管(SW-rt-PA)的溶栓作用，实现血栓的穿透性治疗。

2 结果与讨论

2.1 EcN与SW-rt-PA的制备

EcN培养显示93%高存活率，长度2-3μm。通过酰化反应将rt-PA接枝到羧基化单壁碳纳米管(SW-COOH)表面，经0.45μm滤膜过滤后获得200-300nm的SW-rt-PA，rt-PA载药量达35.23%。原子力显微镜(AFM)显示SW-rt-PA表面存在明显蛋白修饰。

2.2 PMV(L-Arg)的制备

从小鼠外周血分离的血小板经冻融循环获得血小板膜，超声加载L-Arg后形成150nm的PMV(L-Arg)纳米颗粒，L-Arg载药量38.62%。流式细胞术证实99.5%细胞共表达CD61/CD41血小板标志物。

2.3 _SrEcN_PL的构建

通过链霉亲和素-生物素系统将SW-rt-PA和PMV(L-Arg)依次修饰到EcN表面。激光共聚焦显示SYTO9标记的益生菌表面同时存在Cy5.5标记的SW-rt-PA和DiR标记的PMV(L-Arg)。SDS-PAGE证实各组分成功组装，rt-PA活性保留66%。

2.4 功能表征

_SrEcN_PL在磷脂酶A2(PLA2)刺激下48小时内释放70%L-Arg。运动轨迹分析显示其平均迁移速度虽略低于EcN，但仍保持自主运动能力。Transwell实验证实PMV修饰使血小板靶向效率提升3倍。

2.5 体外溶栓与体内靶向

体外溶栓实验显示_SrEcN_PL溶栓效率显著高于游离rt-PA。小鼠颈动脉血栓模型超声检测显示，_SrEcN_PL组10分钟即出现溶栓效应，药代动力学分析其半衰期延长至19.92小时（rt-PA仅0.06小时）。

2.6 体内溶栓效果

超声多普勒显示_SrEcN_PL治疗组血管直径持续增加，NO荧光染色证实L-Arg发挥血管扩张作用。H&E染色显示其溶栓效果优于单药治疗组，且未出现继发血栓。安全性实验表明表面修饰可降低益生菌的肝肾功能毒性。

3 结论

该研究开创性地将益生菌运动性、纳米载体靶向性和药物控释相结合，开发的微棒机器人系统实现了：①基于EcN自主运动的快速血栓渗透；②血小板膜介导的精准靶向；③PLA2响应的药物控释；④rt-PA与L-Arg的协同治疗。为急性血栓性疾病提供了突破性的治疗策略。

4 实验方法

关键技术包括：①EcN的LB培养基培养；②SW-COOH的EDC/NHS活化及rt-PA接枝；③血小板梯度离心分离与膜提取；④链霉亲和素介导的逐层组装；⑤小鼠FeCl₃诱导的血栓模型建立；⑥小动物超声多模态成像评估等。所有动物实验均通过厦门大学实验动物中心伦理审查。