人类iPSC衍生神经干细胞与底板祖细胞的胞内外囊泡miRNA特征谱解析及其在神经发育调控与帕金森病模型中的意义

本研究通过人类诱导多能干细胞(hiPSC)分化为神经干细胞(NSC)和底板祖细胞(FPP)，系统分析了胞内与胞外囊泡(EV)的miRNA表达特征。研究发现FPP与NSC仅存在8种胞内miRNA差异，但EV miRNA差异达27种，其中EXOC5在FPP中显著上调并与初级纤毛功能相关。研究还鉴定出5种跨细胞谱系保守的EV富集miRNA，为神经发育的miRNA调控机制提供了新见解，对帕金森病(PD)模型建立和再生医学具有重要价值。

　　

人类iPSC衍生神经系统的miRNA调控图谱

ABSTRACT

研究团队利用来自三名健康供体的人类诱导多能干细胞(hiPSC)，成功分化为神经干细胞(NSC)和多巴胺能神经元祖细胞——底板祖细胞(FPP)。通过系统分析胞内和胞外囊泡(EV)的miRNA表达谱，发现NSC与FPP仅存在8种胞内miRNA差异，而EV miRNA差异高达27种。靶基因验证显示FPP中EXOC5 mRNA表达显著高于NSC，该基因与初级纤毛功能密切相关。研究还鉴定出5种在三种细胞EV中持续富集的miRNA，为神经发育调控领域提供了重要基础数据。

Graphical Abstract

实验通过hiPSC分化为NSC和多巴胺能神经元祖细胞FPP，并进行microRNA谱分析。虽然胞内差异有限，但EV microRNA显示出27种差异表达miRNA和5种跨谱系保守富集的miRNA。靶分析揭示了祖细胞中Exocyst复合体组分5(EXOC5)的上调，该发现为神经命运调控和多巴胺能神经元在帕金森病中的选择性脆弱性提供了新见解。

1 Introduction

人类神经系统的复杂性体现在其多样的神经元类型上。在发育早期，具有分化为多种神经细胞潜能的神经干细胞(NSC)会特化为特定神经元表型。位于神经管腹侧中线的底板细胞作为中脑多巴胺能神经元的来源，这些神经元在神经退行性疾病帕金森病(PD)中受累。研究表明调控性非编码RNA，包括microRNA(miRNA)，在神经发育过程中动态变化，提示其在干细胞分化过程中转录程序转换的作用。细胞外囊泡(EV)作为miRNA的分泌机制之一，可能通过递送功能性物质调控基因表达和生理过程。

2 Methods

2.1 hiPSCs培养

使用miRNA转染法从男性皮肤成纤维细胞重编程获得hiPSC，所有实验使用来自三名健康受试者的细胞系。hiPSC在Geltrex包被的培养板上用E8培养基培养，每周以1:5-1:10比例传代。

2.2 hiPSC向NSC分化

hiPSC在神经诱导培养基中培养7天，随后在神经扩增培养基中培养并传代4-5次。通过免疫荧光检测Sox1、Nestin、Pax6和Msi1等神经标志物确认NSC身份。

2.3 hiPSC向FPP和多巴胺能神经元分化

使用PSC多巴胺能神经元分化试剂盒，通过底板特化培养基和扩增培养基获得FPP，最终分化为酪氨酸羟化酶(TH⁺)神经元。通过Lmx1a、Foxa2和Otx2等标志物确认FPP身份。

2.5 条件培养基收集和EV分离

收集hiPSC、NSC和FPP的条件培养基，通过差速离心和0.8μm过滤后，使用exoEasy Maxi Kit分离EV。与超速离心相比，该方法获得更高的RNA产量和质量。

2.7 miRNA表达谱分析

使用TaqMan Human MicroRNA Arrays Set v3.0检测754种miRNA。数据预处理包括阈值校正，以C_q=30作为检测阈值，采用全局标准化策略进行数据分析。

3 Results

3.1 hiPSC向NSC和FPP分化及EV分离

成功建立hiPSC向NSC和FPP的分化体系。EV RNA分析显示hiPSC主要含有25-200nt的小RNA峰，而NSC和FPP EV还含有18S和28S rRNA峰，提示神经分化过程中rRNA的选择性释放。

3.2 hiPSC、NSC和FPP的胞内及EV miRNA谱

PCA分析显示神经细胞(NSC和FPP)与hiPSC明显分离，EV样本与其来源细胞也显著不同。已知的多能性miRNA(如miR-302簇)在hiPSC中高表达，而神经分化相关miRNA(如let-7家族、miR-124)在神经细胞中上调。

3.3 NSC与FPP的胞内miRNA差异

发现FPP中5种上调miRNA(hsa-miR-218-5p、-335-5p、-137、-let7-5p和-99b-5p)和2种特异性表达miRNA(hsa-miR-885-5p和-642a-5p)。通路分析显示这些miRNA的预测靶标富集于膜运输通路，其中EXOC5在FPP中显著上调。

3.4 FPP与NSC在EV miRNA中的差异更显著

虽然FPP与NSC仅存在8种胞内miRNA差异，但EV miRNA差异达27种。11种在FPP EV中上调的miRNA中，6种与其胞内表达模式一致，包括let-7b-5p、miR-137、-218-5p等。

3.5 胞内外miRNA表达模式

发现每种细胞群体都有约10种特异性富集于EV的miRNA。例如hsa-miR-1260a在PSC EV中富集，hsa-miR-1226-5p在FPP EV中富集，hsa-miR-1291在两种神经EV中均富集。

3.6 EV中的miRNA特征

鉴定出5种在所有细胞EV中持续富集的miRNA(hsa-miR-1274A、-1274B、-34a-3p、-661和-886-5p)。其中miR-1274A、-1274B和-886-5p在hiPSC中表达更高，提示其可能来源于tRNA或vaultRNA加工。

4 Discussion

4.1 胞内miRNA谱

FPP中上调的miR-218-5p和miR-335-5p分别位于SLIT2/3和MEST基因内含子中，这些基因在底板发育中起关键作用。let-7家族通过LIN28调控，与PD发病机制相关。EXOC5作为miR-642a-5p和miR-218-5p的靶标，在初级纤毛功能和EV释放中起重要作用。

4.2 胞外谱

EV RNA分析发现神经细胞EV中含有18S和28S rRNA，可能与神经分化过程中SIRT1下调导致的rRNA合成增加有关。鉴定出多种EV特异性富集的miRNA，如来源于tRNA的miR-1274和来源于vaultRNA的miR-886-5p。

4.3 研究意义

该研究首次全面表征了从多能状态到神经分化过程中EV miRNA的特征，为神经发育调控提供了新见解。发现的miRNA特征可能用于改进多巴胺能神经元分化方案，并为PD等神经退行性疾病的治疗提供新思路。