ALKBH6作为新型核苷酸去甲基化酶的鉴定及其在N-甲基化核苷酸代谢中的关键作用

本研究首次揭示ALKBH6作为Fe(II)/2OG依赖性双加氧酶，特异性催化7me-GMP和1me-AMP的去甲基化，填补了ALKBH家族酶底物谱的空白。通过HPLC、质谱和酶动力学分析，发现其催化效率优于同类酶，且受2HG抑制。该发现为理解细胞甲基化核苷酸代谢提供了新视角，对肿瘤等疾病研究具有重要意义。

　　

在生命活动中，甲基化修饰广泛存在于DNA、RNA和蛋白质中，而异常的甲基化会导致基因组不稳定和细胞功能紊乱。虽然已知ALKBH（AlkB同源物）家族蛋白能修复甲基化的核酸，但ALKBH6的生理底物长期未知。这项发表在《Journal of Biological Chemistry》的研究，首次系统揭示了ALKBH6作为核苷酸去甲基化酶的全新功能，解决了该领域的关键科学问题。

研究人员采用多学科技术手段：通过2OG（2-氧戊二酸）非偶联反应验证酶活性；利用甲醛脱氢酶(FDH)偶联法实时监测去甲基化效率；结合HPLC和LC/MS（液相色谱-质谱联用）直接鉴定底物转化；采用分子对接和定点突变分析关键氨基酸残基；并通过shRNA（短发夹RNA）敲低和免疫荧光证实内源性功能。

研究结果：

1. 1.

   ALKBH6是功能性Fe(II)/2OG依赖性双加氧酶

   通过2OG非偶联反应证实ALKBH6具有催化活性，其产生的琥珀酸呈剂量依赖性，且可被Co²⁺抑制。

2. 2.

   N-甲基化dNMP和NMP是ALKBH6的主要底物

   ALKBH6特异性作用于7me-GMP/7me-dGMP和1me-AMP/1me-dAMP，对甲基化碱基或核苷无活性。酶动力学显示其对7me-GMP的K_M为1.03 μM，k_cat达10 min^-1，效率显著高于ALKBH2/3。

3. 3.

   质谱验证去甲基化产物

   LC/MS检测到7me-GMP（378.08 m/z）转化为GMP（364.06 m/z），1me-AMP（362.08 m/z）转化为AMP（348.07 m/z），突变体则无此活性。

4. 4.

   关键氨基酸残基的鉴定

   Tyr120通过荧光淬灭和DSF（差示扫描荧光法）被证实为底物结合关键位点，其突变使K_D从0.62 μM丧失。

5. 5.

   内源性底物的确认

   ALKBH6敲除使MCF7细胞中7me-GMP水平从9.06 ng/mL升至12.78 ng/mL，免疫荧光显示1me-A和7me-G信号增强，尤其在MMS（甲磺酸甲酯）处理后更显著。

这项研究不仅拓展了ALKBH家族的功能认知，更揭示了ALKBH6在清除N-甲基化核苷酸中的核心作用。这些核苷酸可能源自mRNA帽结构降解或tRNA/rRNA代谢，其积累可能导致复制错误或转录异常。该发现为理解甲基化相关疾病（如癌症）提供了新靶点，并为开发基于2OG类似物的抑制剂奠定基础。正如作者强调的，ALKBH6与MTH1等"清洁酶"协同，构成了细胞防御甲基化损伤的重要屏障，这一机制在进化上从大肠杆菌AlkB到人类ALKBH6均高度保守。