UnaG蛋白的分子工程：荧光动力学解析与生物传感器潜力开发

（编辑推荐）本研究通过精确定点突变（R112M/R132M/R112&132M）改造UnaG蛋白，显著提升其与未结合胆红素（UC-BR）的结合亲和力（Kd达10-12 nM）及热稳定性（Tm 72℃），为开发高灵敏度BR检测生物传感器奠定基础。

Highlight

突变设计

前期研究中，UnaG蛋白基因由Biomatik公司合成并克隆至pTolT表达载体（图S1）。本研究针对UnaG-UC-BR结合位点的精氨酸（R112/R132）设计甲硫氨酸突变（R112M/R132M/R112&132M），旨在降低结合位点极性。

结果与讨论

野生型UnaG通过精氨酸胍基团增强极性。PyMOL结构模拟（PDB 4i3b）显示，Arg112通过离子偶极作用稳定BR结合，而突变体通过疏水性相互作用重构结合口袋。

突变体TolAIII-UnaG在大肠杆菌中的表达

采用Phusion定点突变技术成功构建突变质粒，琼脂糖凝胶电泳验证DNA产物（图2）。pUC19阳性对照（2686 bp）条带位于2500-3000 bp标记间，证实扩增成功。

UV/VIS光谱分析

突变体apoUnaG在280 nm处显示特征吸收峰（图7）。结合BR后，holoUnaG出现498 nm（R112M）、500 nm（R132M）和495 nm（双突变）特征峰，表明BR结合诱导发色团微环境变化。

荧光光谱与UC-BR滴定

R112M/R132M发射峰位于555-556 nm（激发517-519 nm），而双突变体出现显著蓝移（Ex 504 nm/Em 542 nm）（图8a）。滴定实验显示突变体灵敏度提升，荧光饱和浓度达~10 nM。

远紫外CD光谱分析

apoUnaG变体呈现低椭圆率（图9），表明未折叠状态；结合BR后，负峰（208/222 nm）增强，证实α-螺旋含量增加，β-桶状结构稳定性提高。

热稳定性研究

CD热变性曲线（图10）显示双突变体T_m值最高（72℃），较野生型提升14℃，归因于甲硫氨酸疏水核心的稳定作用。

结论

本研究通过理性设计获得高亲和力（K_d ~10 nM）、高热稳定性（T_m 72℃）的UnaG变体，为开发BR检测诊断工具提供新策略。