花粉管顶端质膜ANX/BUPS-RALF-LLG信号复合体的动态组装与内膜运输调控机制

本研究针对花粉管生长过程中细胞壁完整性维持的分子机制，通过烟草花粉瞬时转化系统揭示了ANX/BUPS受体激酶通过内膜运输途径动态招募RALF肽配体和LLG共受体至顶端质膜形成信号复合体的时空规律。研究发现ANX/BUPS作为支架蛋白决定复合体组装位点，RALF4/19稳定受体-共受体互作，而BFA和Wortmannin处理证实不同组分通过差异囊泡运输途径定位。该成果为理解植物生殖过程中细胞极性生长调控提供了新见解，发表于《Plant Reproduction》。

　　

在植物有性生殖过程中，花粉管作为运送精细胞的"特快专列"，其精准导航和结构完整性维持是受精成功的关键。然而这根比头发丝还细的细胞如何在快速延伸时保持不破裂？科学家们发现这依赖于一套精密的分子信号系统——ANX/BUPS-RALF-LLG信号复合体。虽然已知这些组分在维持花粉管完整性中发挥重要作用，但它们如何在时空维度上动态组装、如何通过内膜系统运输等核心问题仍悬而未决。

为解开这些谜团，Patricia L.Seitz等研究者采用烟草花粉瞬时转化这一经典系统，结合多种荧光标记和药物干扰实验，首次系统揭示了该信号复合体的组装规律和运输机制。研究发现RALF4/19肽配体分泌后主要定位于细胞壁，ANX1/2和BUPS2受体激酶富集在花粉管顶端质膜，而GPI锚定的LLG2/3共受体则特异性地存在于细胞质囊泡中。通过共表达实验证明ANX/BUPS如同"分子磁铁"，能将分散的RALF和LLG招募到质膜形成功能复合体。更有趣的是，内膜运输抑制剂实验显示不同组分通过差异途径运输：BFA处理导致ANX/BUPS完全从质膜消失，而RALF仍保留在细胞壁；Wortmannin则使部分蛋白滞留在膨大的前液泡区室中。

关键技术方法包括：利用LAT52花粉特异性启动子驱动各组分（RALF4/19、ANX1/2、BUPS2、LLG2/3）与荧光蛋白融合表达；通过基因枪法转化烟草花粉；采用BFA（5μM）、Wortmannin（0.35μM）等药物处理干扰内膜运输；使用FM4-64（8μM）和PI分别标记膜系统和细胞壁；借助ZEISS LSM 980共聚焦显微镜进行多通道成像；通过ImageJ进行荧光强度分布和Pearson共定位分析。

"ANX/BUPS-RALF-LLG复合体组分在生长花粉管中呈现差异亚细胞定位模式"部分揭示：RALF4/19-GFP主要定位于细胞壁（与PI信号重叠），胞内可见少量囊泡信号；ANX1/2-GFP和BUPS2-GFP在顶端质膜形成明显富集（与FM4-64共定位）；而SP-mCitrine-LLG2/3仅存在于胞内囊泡（与FM4-64共定位但不与PI重叠）。这些发现通过荧光强度曲线分析和Pearson相关系数得到验证。

"ANX/BUPS作为质膜锚定蛋白招募RALF和LLG"部分证明：单独表达时，RALF和LLG分别位于细胞壁和囊泡；但与ANX1共表达后，两者均被招募至质膜。三重共表达实验进一步显示RALF能稳定ANX/BUPS-LLG互作，如ANX1-RFP+SP-mCitrine-LLG2+RALF4-mTurquiose2三者在质膜完美共定位。

"复合体组分分布的内膜运输需求"部分发现：BFA处理后ANX1/BUPS2完全从质膜消失并聚集在胞质，而RALF4仍保留在细胞壁；LLG2则形成大型胞质聚集体。Wortmannin导致所有组分部分滞留在膨大的前液泡区室，但TyrA23和Endosidin2处理未显著改变定位模式。

该研究首次系统阐明了ANX/BUPS-RALF-LLG信号复合体的动态组装机制：ANX/BUPS作为"组织核心"决定复合体组装位点，通过差异囊泡途径将各组分运输至顶端质膜。这一发现不仅深化了对花粉管极性生长调控的理解，更揭示了植物受体激酶复合体时空组装的普遍规律。特别值得注意的是，与动物细胞中常见的"预组装-运输"模式不同，该信号复合体采用"分散运输-定点组装"策略，这种创新机制可能为植物细胞适应快速生长需求而演化出的特殊策略。研究建立的烟草花粉转化体系也为后续探索其他植物受体复合体提供了方法学范例。这些发现将为改良作物授粉效率、创制新型雄性不育系等农业应用提供理论依据。