二氧化钛纳米管表面诱导骨髓间充质干细胞迁移体形成及其通过CXCL12/CCR4和CCL2/CCR2轴促进骨再生的机制研究

本研究针对骨组织工程中细胞招募和分化的关键问题，通过创新性地利用二氧化钛纳米管(MNT)表面拓扑结构诱导骨髓间充质干细胞(BMSCs)产生富含趋化因子的迁移体(Migs)。研究发现MNT5表面通过上调ITGA5表达显著促进Migs形成，其携带的CXCL12和CCL2可通过JAK-STAT通路增强BMSCs成骨分化、内皮细胞(ECs)血管形成和巨噬细胞M2极化。动物实验证实Migs负载的BCP/GelMA支架能显著促进异位骨形成，为骨再生提供了新型细胞外囊泡治疗策略。

　　

在骨组织工程领域，如何有效招募干细胞并促进其成骨分化一直是重大挑战。传统生长因子递送存在半衰期短、成本高和副作用等问题，而新兴的细胞外囊泡治疗策略为此提供了新思路。其中，迁移体(Migs)作为一种新型膜性细胞器，因其独特的形成机制和内容物选择性装载特性备受关注。然而，现有研究多聚焦于迁移体的生物发生过程，对其在再生医学中的应用潜力，特别是如何通过材料表面工程调控迁移体功能的研究仍属空白。

《Journal of Nanobiotechnology》最新发表的研究创新性地将材料表面拓扑结构与迁移体生物学相结合，揭示了二氧化钛纳米管(TiO₂ NTs)通过调控整合素α5(ITGA5)促进骨髓间充质干细胞(BMSCs)产生治疗性迁移体的分子机制。研究人员采用不同阳极氧化电压(5V、10V、20V)制备了具有梯度尺寸的二氧化钛微坑/纳米管(MNT)表面，通过活细胞追踪、超高分辨率成像和蛋白质组学等技术，系统研究了纳米拓扑结构对迁移体形成和功能的影响。

关键技术方法包括：1)通过HF酸蚀和阳极氧化制备梯度尺寸MNT表面；2)使用超速离心结合提取缓冲液纯化迁移体；3)Tandem Mass Tags(TMT)定量蛋白质组学和趋化因子芯片分析迁移体内容物；4)建立大鼠异位骨形成模型评估BCP/GelMA复合水凝胶的成骨效能；5)采用RNA-seq和通路抑制剂(AG490)解析JAK-STAT信号通路作用。

【Migs形成依赖于纳米管尺寸并通过ITGA5上调实现】

研究首先证实MNT表面显著促进BMSCs迁移和迁移体形成，其中5V阳极氧化制备的MNT5表面效果最佳，迁移体数量较光滑表面增加2倍。机制研究发现ITGA5在MNT5表面表达上调3倍以上，免疫荧光显示迁移体与ITGA5在细胞边缘高度共定位。原子力显微镜(AFM)检测显示迁移体区域弹性模量较细胞体高10倍，符合经典迁移体特征。

【迁移体富含CXCL12和CCL2趋化因子】

通过TMT蛋白质组学分析发现，迁移体中327种蛋白表达上调，其中"细胞外"类别差异最显著。趋化因子芯片显示CXCL12和CCL2含量最为丰富，ELISA验证其浓度分别达到细胞体内的4.6倍和5.2倍。这种独特的趋化因子谱为后续功能研究奠定了基础。

【CXCL12/CXCR4轴介导BMSCs和ECs招募与分化】

Transwell实验显示迁移体可剂量依赖性促进BMSCs迁移，中和CXCL12或阻断其受体CXCR4(使用AMD3100)能显著抑制该效应。RNA-seq分析揭示迁移体处理激活JAK-STAT通路，免疫荧光显示成骨标志物osterix(OSX)和osteopontin(OPN)表达增加4倍，该效应可被JAK2抑制剂AG490逆转。类似地，迁移体通过CXCL12/CXCR4轴促进HUVECs血管网络形成，分支数量增加2倍。

【CCL2/CCR2轴驱动巨噬细胞M2极化】

研究发现迁移体可使巨噬细胞迁移能力提高10倍，主要依赖CCL2/CCR2轴。免疫荧光显示M2标志物CD163表达增加3倍，同时促炎因子IL-1β和IL-6分泌减少，抗炎因子IL-10和TGF-β1增加4倍，表明迁移体可塑造有利于骨再生的免疫微环境。

【动物实验证实迁移体促进异位骨形成】

将迁移体负载于BCP/GelMA支架植入大鼠皮下，7天后CD90⁺ BMSCs和CD31⁺ ECs数量分别增加8.9%和17.6%。Micro-CT显示2周时新骨体积增加3.2倍，组织学可见丰富CD163⁺巨噬细胞和OSX⁺成骨细胞浸润，4周时骨小梁密度进一步提高。

该研究首次阐明材料表面纳米拓扑结构可通过ITGA5调控迁移体生物发生，并创新性地将BMSCs来源迁移体应用于骨再生。迁移体独特的"趋化-分化"双功能特性突破了传统生长因子治疗的局限性，其内容物自然组合模式可能比单一因子递送更具生理相关性。特别是迁移体可同时调控BMSCs、ECs和巨噬细胞三种关键细胞类型，实现了骨再生过程中"成骨-血管化-免疫调节"三重协同效应。研究为设计新一代智能骨修复材料提供了理论依据，迁移体作为天然信号分子载体在组织工程领域展现出广阔应用前景。