冰晶生长与细胞存活：成核温度与羟乙基淀粉对极端温度波动下细胞活性的影响机制研究

本研究针对冷冻细胞产品在运输/处理过程中因温度波动导致的冰晶重结晶损伤问题，通过低温显微镜技术模拟-30°C至-10°C的瞬时升温事件（TWEs），揭示5%二甲基亚砜（DMSO）与6%羟乙基淀粉（HES）组合方案及降低成核温度（-15°C）可协同提升Jurkat细胞存活率（p<0.05），为优化冷冻治疗方案提供新策略。

　　

在生物医药领域，冷冻细胞产品的运输和储存如同在刀尖上跳舞。温度计上几度的波动，就可能让价值连城的干细胞治疗产品变成一堆无用的冰晶废墟。这种被称为"瞬时升温事件"（Transient Warming Events, TWEs）的现象，已成为困扰全球生物银行的隐形杀手。传统观点认为，冰晶重结晶是损伤细胞的罪魁祸首，但加拿大阿尔伯塔大学的研究团队通过精密实验发现，真相远比想象复杂。

研究团队从临床痛点切入：脐带血单位在运输过程中经历的-30°C至-10°C温度波动，会导致干细胞活性和功能显著下降。现有冷冻方案中，二甲基亚砜（DMSO）浓度从2.2%到20%不等，羟乙基淀粉（HES）的使用更是千差万别。更棘手的是，常规控速冷冻仪产生的成核温度差异可达10°C，这些变量如何影响细胞抵御温度波动的能力？为解答这些问题，Nishaka William团队设计了一套精密的实验体系。

关键技术方法包括：采用Linkam FDCS196低温显微镜平台模拟真实运输温度曲线，在-5°C或-15°C诱导成核后，以2°C/min降至-50°C；通过Jurkat细胞模型（ATCC TIB-152）评估5% DMSO与5% DMSO+6% HES（670/0.75）两种冷冻保护剂方案；利用Celleca MX细胞计数器进行膜完整性定量分析（AO/PI染色）；结合线性回归模型分析五次TWEs中冰晶面积变化趋势。

冰晶生长动力学研究

在-10°C峰值温度下，冰晶面积增长最为显著（p<0.01）。令人意外的是，添加HES虽然加速重结晶（p=3.66E-09），却提升细胞存活率（p=1.13E-05）。-15°C成核产生的冰晶初始面积更小（p=0.002），且低成核温度在-20°C TWE中显示出保护效应（p=0.007）。这些发现颠覆了"冰晶大小决定损伤程度"的传统认知。

细胞存活率分析

单次TWE实验显示，-10°C组存活率显著低于-20°C/-30°C组（p<0.005）。HES的加入使存活率提升40%-60%，尤其在-15°C成核条件下效果更佳。值得注意的是，-20°C与-30°C组的冰晶生长无差异，但存活率差异显著，暗示除重结晶外，温度依赖性膜应激是关键损伤机制。

作用机制探讨

通过Fox方程计算发现，6% HES将玻璃化转变温度（Tg′）提升80-90°C，限制渗透压应激的作用窗口。低温成核则通过奥斯特瓦尔德熟化理论（Ostwald ripening）产生尺寸均一的冰晶，减缓重结晶速率。研究还提出"双Tg匹配"概念：当细胞内外玻璃化温度同步提升时（如添加脯氨酸），可进一步抵抗深度低温（-120°C）下的损伤。

这项发表于《Journal of Thermal Biology》的研究，为优化细胞治疗产品冷冻方案提供了三重启示：精确控制成核温度（建议-15°C）、合理配伍高分子量CPAs（如HES 670/0.75）、同步调控细胞内外Tg值。这些发现不仅解释临床观察到的方案差异性，更为制定抗温度波动的标准化冷冻协议奠定理论基础。未来研究需在干细胞产品中长期冻存模型中验证这些发现，并探索Tg调节剂在复杂生物制剂中的应用潜力。