靶向RNA隐蔽结合位点的小分子设计：通过碱基置换策略开发高亲和力核糖开关配体

本研究针对RNA靶向小分子普遍存在的溶解性差、亲和力弱及特异性不足等问题，创新性地采用钴胺素(Cbl)作为"宿主分子"搭载多样化β-轴向修饰基团，系统研究了env8甲基钴胺素(MeCbl)选择性核糖开关的配体识别机制。通过结合化学信息学建模与结构生物学手段，研究人员发现了一个可被β-轴向基团占据的隐蔽结合位点，成功开发出亲和力超越天然配体(KD达1.0±0.6 nM)的小分子化合物，并首次报道了非Cbl结构的竞争性抑制剂。该研究为RNA靶向药物设计提供了新范式，相关成果发表于《Nature Chemical Biology》。

　　

在生命活动的分子舞台上，RNA长期扮演着被忽视的配角角色。尽管人类基因组中约80%的RNA具有重要功能，但迄今为止，美国FDA批准的非核糖体RNA靶向药物仅有治疗脊髓性肌萎缩症的risdiplam一种。这种"RNA不可成药"的困境主要源于三个关键瓶颈：溶解性差、结合力弱(K_D通常在微摩尔级)、以及难以实现特异性识别。核糖开关作为自然界进化出的精密RNA-小分子识别系统，为破解这些难题提供了理想模型，其中钴胺素(Cbl)核糖开关因其在细菌代谢中的核心作用而备受关注。

为突破现有技术局限，科罗拉多大学博尔德分校的Lukasz T. Olenginski团队创新性地提出了"宿主-客体"分子设计策略。该研究以钴胺素为可溶性载体，通过其β-轴向位置搭载多样化化学基团，构建了包含44种衍生物的分子库。这种设计巧妙地将传统难以溶解的芳香环系统"嫁接"到水溶性良好的钴胺素骨架上，既解决了溶解性问题，又能精确控制结合位点的空间定位。

研究人员首先建立了系统的实验技术体系：采用荧光探针(CNCbl-5×PEG-ATTOS90)竞争置换法测定结合亲和力，检测限低至1nM；开发基于绿色荧光蛋白(GFPuv)报告基因的细菌细胞筛选系统定量调控活性；通过X射线晶体学解析了14种复合物结构；结合1μs级分子动力学(MD)模拟分析碱基动态位移机制。特别值得注意的是，研究团队还创新性地将化学信息学方法引入RNA靶向研究，建立了预测性能优异的定量构效关系(QSAR)模型(Q2=0.72)。

<关键实验技术>

研究主要采用：1) 非还原合成法制备β-轴向修饰的Cbl衍生物库；2) 荧光探针置换法测定RNA结合亲和力；3) 大肠杆菌报告系统评估配体调控功能；4) X射线晶体学解析RNA-配体复合物结构(分辨率最高达1.8?)；5) 全原子分子动力学模拟结合位点动态变化；6) 化学信息学建模预测构效关系；7) 等温滴定量热法(ITC)验证高亲和力结合；8) 微量热泳动(MST)技术检测非Cbl类抑制剂结合。

<研究结果>

<设计靶向隐蔽位点的cbl衍生物库>

通过系统改变β-轴向基团的化学结构，研究团队发现双环芳烃衍生物29展现出7±7nM的超高亲和力，比先导化合物4提高30%。引人注目的是，含三唑结构的衍生物63和64通过结合G19磷酸骨架和π-π堆积作用，将亲和力进一步提升至1nM水平，ITC验证其在pH5条件下结合能提高1.7倍。这些发现证实了"阳离子-π相互作用"的设计理念。

通过线性判别分析(LDA)发现，强效配体具有更多氢键供体(平均3.2个)，而弱结合物则富含sp³杂化中心。基于此建立的R2-focused模型成功预测了新型先导化合物45-48的结合特性(r.m.s.e.=0.65)。模型筛选出的候选分子中，联苯类似物45的实测亲和力比预测值提高100倍，凸显了双环系统的优势。

<结构生物学揭示碱基置换机制>

晶体结构解析显示，所有β-轴向基团均通过置换A20碱基进入一个>340?3的隐蔽空腔。特别是env2-Cbl63结构首次捕捉到A20以罕见垂直取向与配体π-π堆积的状态。分子动力学模拟揭示A20存在两种构象，其中55%概率保持部分堆叠，这种动态平衡显著降低了碱基位移的能垒。

<发现非cbl结构竞争性抑制剂>

通过28,000分子虚拟筛选获得的联苯类化合物68和71，能以亚微摩尔级亲和力(K_D=400-600nM)竞争性结合核糖开关。凝胶迁移实验(EMSA)证实这些分子特异性占据Cbl结合位点，但无法诱导RNA构象变化，成为首类非Cbl结构的核糖开关拮抗剂。

这项研究通过多学科交叉方法，系统阐明了碱基置换型RNA-小分子识别机制的结构基础。其创新价值主要体现在三个方面：首先，建立的"宿主-客体"设计策略成功解决了RNA配体溶解性难题；其次，发现的隐蔽结合位点拓展了RNA靶向化学空间；最重要的是，研究证实传统认为"不可成药"的RNA结构可以通过动态构象变化产生全新结合口袋。这些发现不仅为开发细菌核糖开关靶向抗生素提供了新思路，其揭示的π-π堆积优化原则和阳离子-π相互作用设计策略，对治疗性RNA配体的开发具有普遍指导意义。正如研究者指出，这种基于天然RNA-配体相互作用的设计范式，有望成为破解RNA靶向药物开发瓶颈的关键钥匙。