基于96孔板微型搅拌棒吸附分散微萃取技术的人血清膀胱癌生物标志物高通量分析方法研究

为解决临床实验室对膀胱癌生物标志物高通量检测的需求，研究人员开发了一种基于96孔板平台的微型搅拌棒吸附分散微萃取(mSBSDME)技术，结合强阳离子交换磁性材料(CoFe2O4-SCX)和LC-MS/MS，实现了血清中异丁酰肉碱(isoC4)和戊酰肉碱(C5)的快速检测。该方法检测限低至0.1-0.3 ng mL-1，通量显著提升，为癌症代谢研究提供了高效分析工具。

　　

膀胱癌作为全球高发恶性肿瘤，其早期诊断面临重大挑战。近年研究发现，短链酰基肉碱（short-chain acylcarnitines）中的异丁酰肉碱（isobutyrylcarnitine, isoC4）和戊酰肉碱（valerylcarnitine, C5）具有100%特异性，成为极具潜力的膀胱癌生物标志物。然而传统检测方法如干血斑技术（DBS）存在耗时长、通量低等缺陷，而固相微萃取（SPME）虽有所改进，仍需30-60分钟提取时间，难以满足临床实验室对大批量样本快速筛查的需求。

针对这一技术瓶颈，来自西班牙巴伦西亚大学的研究团队在《Microchemical Journal》发表创新成果，开发了基于96孔板平台的微型搅拌棒吸附分散微萃取（miniaturized stir bar sorptive dispersive microextraction, mSBSDME）技术。该研究通过将磁性纳米颗粒（CoFe₂O₄）嵌入强阳离子交换聚合物（SCX），构建了新型复合吸附材料，结合96孔板同步处理技术，实现了1分钟内完成96个血清样本的高效富集。

关键技术方法包括：1）合成CoFe₂O₄-SCX磁性复合材料；2）建立96孔板平行处理系统；3）优化pH依赖性离子交换提取条件；4）采用LC-MS/MS进行定量分析。研究使用5名健康志愿者血清样本进行验证。

3.1 磁性复合材料选择与性能

通过比较SCX、混合模式(MCX)和弱阳离子交换(WCX)材料，证实CoFe₂O₄-SCX因磺酸基团的高电荷密度表现最佳，对isoC4和C5的提取效率分别达37%和32%。扫描电镜显示磁性纳米颗粒均匀分布在聚合物表面，饱和磁化强度为32 emu g^-1，满足快速磁分离需求。

3.3 样本稀释优化

采用1:1稀释比例平衡基质效应与灵敏度，发现磷酸盐缓冲液(PBS)与0.1%甲酸水溶液等体积混合可有效克服高盐干扰，同时保持足够分析物浓度。

3.4 提取条件优化

通过Plackett-Burman设计和响应面法确定最佳参数：0.5 mg吸附剂、40 μL解吸体积、0.1%甲酸浓度。仅需1分钟提取/解吸时间，较传统SPME提速30倍以上。

3.6 方法学验证

建立的外标法线性范围1-100 ng mL^-1（R²>0.998），检测限达0.1 ng mL^-1（isoC4）和0.3 ng mL^-1（C5）。同位素内标isoC4-d₉有效校正基质效应，实际样本回收率95-120%，日内精密度RSD<14%。

3.8 实际样本分析

在5例健康志愿者血清中检出isoC4（24-54 ng mL^-1）和C5（39-64 ng mL^-1），证实方法适用性。绿色评估工具AGREEprep评分0.65，通量优势显著。

该研究通过创新性地整合分散微萃取、磁性材料和96孔板平行处理技术，突破了传统生物标志物检测的 throughput 瓶颈。相较于文献报道方法，样本用量减少40倍（仅需100 μL血清），单批次处理能力提升96倍，为大规模癌症筛查研究提供了关键技术支撑。未来通过扩大临床样本验证，有望建立膀胱癌血清诊断阈值，推动代谢组学在肿瘤早诊中的应用。