双重实时逆转录重组酶聚合酶扩增技术的开发与应用：快速鉴别鹅星状病毒1型和2型基因型

为解决鹅星状病毒(GAstV)基因型快速鉴别难题，研究人员基于ORF1b基因开发了双重RT-qRPA检测技术。该研究通过优化RPA引物和exo探针浓度，在42°C下20分钟内实现GAstV-1和GAstV-2同步检测，灵敏度达102拷贝/反应，临床样本检测与RT-qPCR结果100%一致，为基层现场检测提供高效技术支撑。

　　

鹅星状病毒(GAstV)近年来在中国鹅养殖业引发大规模痛风疫情，感染雏鹅死亡率高达50%，造成重大经济损失。更棘手的是，GAstV存在1型(GAstV-1)和2型(GAstV-2)两种基因型，其临床症状相似但基因组差异显著，且常出现混合感染。传统病毒分离耗时费力，而常规RT-qPCR虽精准却依赖昂贵设备，难以在养殖场等基层场景应用。面对这一困境，石家庄海关技术中心的Wenyang Liu团队在《Poultry Science》发表研究，开发出新型双重实时逆转录重组酶聚合酶扩增(RT-qRPA)检测技术，为疫情现场防控提供"快准稳"的解决方案。

研究采用三大关键技术：针对ORF1b基因设计特异性RPA引物与exo探针，通过便携式Genie III荧光检测仪实现双通道同步监测；构建GAstV-1/2体外转录RNA标准品进行灵敏度标定；采集河北地区104份雏鹅肝脏和泄殖腔拭子进行临床验证。

【最优引物筛选】

通过6对GAstV-1和3对GAstV-2引物的基础RPA扩增筛选，最终确定GAstV-1的RT-qRPA-F2/R2（155bp）和GAstV-2的RT-qRPA-F3/R3（206bp）组合，其扩增效率高且无非特异性条带。

【体系优化】

在42°C反应条件下，确定最佳引物/探针浓度：GAstV-1为0.4μmol/L引物+0.24μmol/L探针，GAstV-2为0.4μmol/L引物+0.12μmol/L探针。该体系下两种病毒的特异性扩增曲线分离良好，20分钟内完成检测。

【灵敏度与特异性】

采用Probit分析确定检测限：GAstV-1为109拷贝/反应（95%CI:87.93-169.73），GAstV-2为86拷贝/反应（95%CI:65.11-179.02）。双通道检测仅对目标病毒响应，与禽流感病毒(H9亚型)、鸭呼肠孤病毒等常见禽病原体无交叉反应。

【临床验证】

104份临床样本检测显示：GAstV-1阳性率18.27%（19/104），GAstV-2达66.35%（69/104），混合感染率15.38%（16/104）。与金标准RT-qPCR相比，诊断符合率100%，且TT值与CT值呈现显著线性相关（R²>0.94）。

该研究突破性实现了GAstV双基因型同步现场检测，其反应时间较RT-qPCR缩短70%，且无需复杂热循环设备。值得注意的是，临床数据证实GAstV-2已成为优势流行株，这一发现为疫情防控策略制定提供关键依据。研究者特别指出，该技术对引物-探针错配具有较高容忍度，能有效应对病毒变异挑战。未来结合快速核酸提取技术，可进一步实现"样本进-结果出"的全程现场检测，为水禽疫病防控提供创新技术范式。