人类近端小管上皮细胞通过巨胞饮作用高效摄取抗miRNA抑制剂的机制研究

本研究针对抗miRNA抑制剂(antimiRs)在肾脏疾病治疗中的递送难题，首次揭示了人类近端小管上皮细胞(PTEC)通过巨胞饮作用(macropinocytosis)而非巨蛋白(megalin)介导的内吞途径摄取裸antimiR的分子机制。研究人员采用原代PTEC模型，结合温度依赖性实验和通路抑制剂(EIPA/RAP)验证，发现40nM浓度即可实现有效摄取，为开发无转染试剂的肾脏靶向治疗策略提供了重要理论依据。

　　

在生物医学领域，微RNA(miRNA)作为基因表达的精细调控者，已成为疾病治疗的新靶点。这些长约22个核苷酸的非编码RNA能够通过与靶mRNA的3'非翻译区结合，像分子剪刀般抑制蛋白质翻译或促进mRNA降解。抗miRNA抑制剂(antimiRs)作为阻断特定miRNA活性的工具，在肾脏疾病治疗中展现出巨大潜力，特别是在肾移植相关的缺血再灌注损伤中。然而，如何让这些"基因药物"精确抵达靶细胞，始终是制约其临床应用的关键瓶颈。

肾脏因其独特的解剖结构，成为寡核苷酸类药物较易靶向的器官。小于6nm的antimiR可自由通过肾小球滤过屏障进入小管腔，但如何被近端小管上皮细胞(PTEC)有效摄取仍不清楚。先前研究显示，在离体肾脏灌注模型中，antimiR能在无转染试剂辅助下被PTEC摄取，但具体内吞机制尚未阐明。这个问题至关重要，因为了解细胞摄取途径不仅能优化给药策略，还可能影响药物的胞内运输和最终疗效。

为破解这一科学难题，Emily K. Glover领衔的国际研究团队在《Scientific Reports》发表了创新性成果。研究人员聚焦两种主要内吞途径：巨蛋白(megalin)介导的受体依赖性内吞和巨胞饮作用(macropinocytosis)。前者是PTEC重吸收滤过蛋白的经典途径，后者则是通过细胞膜皱褶形成大囊泡的非选择性摄取机制。通过系统研究，团队首次证实人类原代PTEC主要通过巨胞饮途径摄取裸antimiR，这一发现为开发肾脏靶向的基因治疗策略提供了重要理论基础。

研究采用多项关键技术：从移植弃用的人肾中分离原代PTEC并建立Transwell培养模型；使用荧光标记的antimiR(FAM)通过温度实验验证主动运输；采用共聚焦显微镜分析antimiR与内吞标记物(葡聚糖/白蛋白)及晚期内体标志物RAB7的共定位；利用特异性抑制剂5-(N-乙基-N-异丙基)阿米洛利(EIPA)和受体相关蛋白(RAP)分别阻断巨胞饮和巨蛋白途径；通过流式细胞术和siRNA敲低验证关键结果。

AntimiR uptake by PTEC is temperature dependent

通过对比37°C和4°C条件下的摄取实验，发现低温使antimiR阳性区域从8.58%降至2.24%，证实摄取是能量依赖的主动过程。虽然低温使细胞活力从91.5%降至79.5%，但不足以解释如此显著的摄取抑制，有力支持了内吞机制的存在。

AntimiR uptake is concentration and time dependent

研究发现40nM浓度即可实现有效摄取，阳性区域达49%，远低于常规转染所需的微摩尔级浓度。流式细胞术显示摄取随时间稳步增加，24小时达到平台期。值得注意的是，裸antimiR的递送效率与转染试剂相当，但细胞间分布更均匀。

AntimiR colocalizes with endocytosis markers

共聚焦显微镜显示，antimiR与内吞示踪剂Texas Red-葡聚糖的共定位系数达0.854，与白蛋白达0.943，与晚期内体标志物RAB7达0.308，确证其通过典型内吞途径进入细胞。

Blocking macropinocytosis reduces antimiR uptake

使用500nM EIPA抑制Na-H交换器后，antimiR摄取降至对照的56%，葡聚糖摄取降至28%，表明显著的巨胞饮依赖。值得注意的是，EIPA对白蛋白摄取的影响不显著，暗示PTEC存在多种白蛋白内吞途径。

Megalin inhibition does not reduce antimiR uptake

尽管受体相关蛋白(RAP)成功将白蛋白摄取抑制到对照水平的约60%，但对antimiR摄取无显著影响。siRNA敲低巨蛋白表达的实验也得到一致结果，排除了受体介导内吞的主要作用。

这项研究首次系统阐明了人类原代PTEC摄取裸antimiR的分子机制，具有多重科学意义。在理论层面，发现巨胞饮作为主导途径的结论颠覆了传统认知，因为PTEC通常以巨蛋白介导的内吞闻名。这一发现扩展了我们对不同物质胞吞选择性的理解，提示细胞可能根据分子特性"选择"最佳内吞途径。

在技术层面，研究建立的40nM有效浓度标准，显著低于既往报道的"裸递送"所需浓度，为降低治疗成本和提高安全性提供了参考。原代细胞模型的成功应用也证明，相较于永生化细胞系，原代PTEC更能反映体内真实的药物摄取特性。

最具突破性的是临床转化价值。由于巨胞饮在多种细胞中普遍存在，这一发现可能推及其他器官的寡核苷酸递送研究。研究者特别指出，巨胞饮的活性可通过表皮生长因子受体等途径调控，这为开发联合用药方案以提高antimiR递送效率指明了方向。此外，避免使用转染试剂不仅简化生产工艺，更能减少潜在免疫毒性，对肾脏局部给药(如机器灌注期间)的临床实践具有直接指导意义。

该研究也存在若干待解问题。EIPA仅部分抑制antimiR摄取，提示可能存在其他次要途径；巨胞饮囊泡的后续胞内运输轨迹及其与药物活性的关系也需深入探索。未来研究可结合早期内体标记物追踪antimiR的实时运输，并比较不同递送方式对基因沉默效率的影响，以全面优化治疗策略。这些发现共同构成了肾脏靶向基因治疗发展道路上的重要里程碑。