空间长读长测序技术揭示人类大脑皮层发育中剪接与多聚腺苷酸化的细胞类型特异性调控

这篇研究通过创新的空间长读长测序技术（Spl-ISO-Seq）结合计算工具Spl-ISOquant，首次在近单细胞分辨率下解析了人类视觉皮层发育关键期（青春期前后）的RNA可变剪接（AS）和多聚腺苷酸化（poly(A)）调控网络。研究发现皮层（尤其是第4层）比白质具有更强的剪接调控，且兴奋性神经元中突触后相关基因的剪接变化与自闭症风险基因显著重叠。该技术将空间分辨率提升至10μm，并通过外显子富集和长cDNA捕获策略使读长增加2.7倍，为复杂组织的异构体研究提供了新范式。

　　

技术突破：空间长读长测序的全新范式

研究团队开发的Spl-ISO-Seq技术通过两项关键创新实现了突破：一是采用Agilent外显子捕获探针富集剪接分子，二是通过1.25M NaCl-20% PEG缓冲液中的0.48× SPRIselect beads筛选长cDNA。这使得中位读长从502bp提升至1358bp，外显子覆盖数从4个增至5个，转录本覆盖率从49%提升至70%。配套开发的Spl-ISOquant软件通过k-mer索引和Smith-Waterman算法实现14bp条形码的精准识别（精度99.5%），克服了传统空间技术因条形码碰撞导致的解析难题。

发育调控的皮层-白质差异图谱

比较8-11岁（儿童）与16-19岁（青年）视觉皮层样本发现：

1. 1.

   区域特异性：皮层18.54%的外显子存在发育调控，显著高于白质的6.14%（p=1.1×10^-11）。例如SLC12A2基因外显子在皮层包含率从19.3%增至70.2%，而白质无变化。

2. 2.

   细胞类型分化：兴奋性神经元中73.5%的差异剪接外显子呈现青春期后包含率下降趋势（ΔΨ=-0.04），而少突胶质细胞的调控在白质更活跃（20% vs 皮层0%）。

3. 3.

   功能关联：SynGO分析显示皮层差异剪接基因富集于突触后密度（FDR<10^-6），且ARM重复结构域在儿童高表达，而电压门控钾通道结构域在青年期上调。

第四层的调控中心地位

分层分析揭示：

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  剪接热点：L4发育调控外显子占比16.12%，高于L1-3（13.57%）和L5-6（12.45%）。例如TSPAN19基因在L4呈现儿童期包含/青年期跳过的显著转换。

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  重复元件关联：差异外显子下游LTR/ERV1重复序列富集（p=0.004），提示转座元件可能参与调控。

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  结构影响：RiboSplitter分析发现47.2%的差异事件导致阅读框移位，如DRG1基因外显子跳跃改变GTP结合域构象，该基因与自闭症和小头畸形相关。

多聚腺苷酸化的协同调控

皮层24.67%的基因存在发育相关的poly(A)位点转换，呈现三个特征：

1. 1.

   长度偏好：调控基因的3'UTR在白质更短（315-326bp vs 皮层426-428bp，p<10^-4）。

2. 2.

   协同性：31.2%的差异剪接基因同步发生poly(A)位点变化（p=1.49×10^-16），如VBP1基因在皮层新增远端poly(A)位点使用。

3. 3.

   疾病关联：皮层差异剪接基因与自闭症风险基因在L1-3的OR值达1.86（95%CI 1.42-2.30），显著高于其他皮层区域。

技术局限与未来方向

当前方法仍受限于：

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  仅6.35%的reads捕获转录起始位点（TSS），限制全长异构体分析

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  10μm分辨率下单细胞数据稀疏性影响低频事件检测

  研究者建议整合5'TSO的空间技术（如Visium）以提升全长转录本覆盖率，这将有助于解析启动子选择与剪接的协同调控机制。