AlphaFold模拟多聚泛素复合物及共价连接蛋白的结构解析新策略

本研究针对AlphaFold(AF)在预测多聚泛素(polyUb)复合物结构时的局限性，创新性地提出两种策略：通过关联半胱氨酸突变诱导特异性连接，以及在AlphaFold3(AF3)中引入短共价连接体模拟异肽键。研究成功构建了预定连接方式的多聚泛素链，揭示了二泛素(diUb)复合物的替代结合模式，并通过交联质谱(XL-MS)验证了距离约束的有效性。该成果为破解“泛素密码”提供了新工具，且方法可推广至其他共价连接体系的整合结构建模。

　　

细胞通过泛素(Ub)这种“分子标签”的共价修饰，精确调控蛋白质的命运——从定位改变到降解标记。这种调控的核心在于多聚泛素链(polyUb)复杂的连接方式：7种赖氨酸(K)或N端(M1)与C端(G76)通过异肽键形成的线性或分支结构，构成了被称为“泛素密码”的调控语言。例如，K48连接链引导蛋白质走向蛋白酶体降解，而K63连接链参与DNA损伤修复。然而，这种密码的“语法规则”尚未完全破译，尤其对于非经典连接方式(K6/K11/K27/K29/K33)和分支链的功能认知仍存在大量空白。

传统结构预测工具AlphaFold(AF)虽革新了蛋白质结构研究，但其无法建模链间共价连接的特性，限制了在polyUb领域的应用。更棘手的是，泛素序列的高度保守性和海量相互作用伙伴，使得协同进化信号被严重稀释。当面对由不同连接方式组合产生的指数级复杂度时，实验解析所有可能性显然不现实，这凸显了发展计算预测工具的迫切性。

来自德国马克斯·普朗克生物物理研究所的Balázs Fabian和Jan F.M. Stuke团队在《Cell Reports Physical Science》发表研究，提出两种突破性解决方案。第一种方案沿用蛋白质化学经典思路：将目标赖氨酸和C端突变为半胱氨酸，利用二硫键强制拉近泛素单体。在AF2.3和AF3中，这种关联突变显著改善了二泛素(diUb)与相互作用蛋白复合体的预测，尤其当二硫键形成时，预测结构与实验数据的C_α-RMSD中位数从15?降至5?以下。有趣的是，对蛋白酶体亚基ADRM1-diUb复合物的“预测失败”，实际揭示了NMR实验中观察到的动态多结合位点特征，而AF3成功捕捉了这些替代构象。

更具革新性的是第二种方案——利用AF3新支持的配体共价连接功能，设计“异肽键模拟器”。研究者用丙烷分子作为桥梁，将其C_β与目标丙氨酸(替代赖氨酸)连接，另一端酯化到G76的OXT原子上。这种设计精确复现了异肽键的原子间距(3-5?)，且无需繁琐的突变序列设计。在测试的8个diUb-相互作用蛋白复合体中，该方法使正确预测比例从12%提升至62%。特别引人注目的是对去泛素化酶USP54-triUb体系的预测：晶体对称性曾模糊了泛素连接关系，而AF3不仅重现了实验结构，还揭示了酶活性位点附近难以捕捉的过渡态构象。

技术方法上，研究团队建立了系统的评估体系：选取8个含不同连接类型的diUb复合体晶体/NMR结构作为基准；通过局部AlphaPulldown实现AF2多模型预测；利用AF3的50随机种子×10扩散采样增强构象覆盖；采用刚性对接和最小C_α-RMSD筛选最优预测；通过二硫键形成率、 linker完整性等指标量化预测质量。

研究结果部分展现出多层次突破：

关联半胱氨酸突变改善AF2和AF3对复合物中diUb的预测

通过Ub KxC(如K63C)和Ub C77突变，在AF2.3中使二硫键形成率提升至40%，AF3中达65%。当二硫键形成时，预测质量评分(0.8×ipTM+0.2×pTM)与实验结构的RMSD呈强负相关，为结果可靠性提供双重验证。

共价连接体提升AF3对diUb复合物的预测精度

丙烷连接器使异肽键原子间距误差<1?，对分支triUb复合物(如Ufd4-[Ub]₂-K29/K48)的预测RMSD从25.9?降至8.4?。在合成抗原结合片段sAB-K29的“疑难案例”中，引入DSSO交联剂距离约束后，diUb定位精度提升300%。

异肽键模拟物实现polyUb的精准连接

拓展应用显示，该方法可构建含M1/K11/K48连接的六聚泛素等复杂拓扑结构。通过替换连接分子(如用丁烷调节长度)，还能适应不同共价连接类型，包括链中二硫键等特殊修饰。

在讨论中，作者强调该方法的普适价值：不仅限于泛素体系，还可应用于类泛素蛋白(SUMO)、E1/E2/E3酶-底物复合物、含异肽键的抗生素肽等场景。对于PROTAC等双功能分子诱导的三元复合物预测，共价约束策略可大幅减少构象搜索空间。随着AF3化学感知能力的持续增强，这种“计算脚手架”技术有望成为整合结构生物学的新范式。

这项研究的意义在于：首次在AF框架内实现了共价连接蛋白的精准建模，突破了“泛素密码”解析的计算瓶颈；提出的异肽键模拟策略简洁高效，避免了传统突变方法对MSA的依赖；为研究PTM(翻译后修饰)的动态调控提供了新工具。正如审稿人所言：“这项工作将AlphaFold的应用疆域拓展到了后翻译修饰的星辰大海”。