新型抗体1B12和11G2助力亨廷顿病HTT1a蛋白的Western blot检测与定量研究

为解决亨廷顿病(HD)中致病性HTT1a蛋白难以直接检测的难题，研究人员通过开发靶向C端八肽的neo-epitope单抗1B12/11G2，首次在HD基因敲入小鼠脑组织中发现HTT1a呈现CAG重复数依赖的条带和高分子量(HMM) smear特征，并证实MSH3沉默可显著降低smear水平。该研究为HD治疗靶点筛选提供了新型定量检测工具。

　　

亨廷顿舞蹈症作为一种致命的神经退行性疾病，其核心病理特征与亨廷顿蛋白(HTT)基因中CAG三核苷酸异常重复扩展密切相关。近年来科学家发现，异常剪接产生的HTT^1a mRNA所编码的毒性外显子1蛋白在疾病进程中扮演关键角色。然而由于缺乏特异性检测手段，HTT^1a在脑组织中的表达特征与致病机制始终笼罩着神秘面纱。传统检测方法如均相时间分辨荧光(HTRF)和免疫沉淀虽能间接反映HTT^1a存在，但存在耗样量大、成本高昂等局限，更无法直观展现蛋白的分子特征。

为突破这一技术瓶颈，来自麻省总医院和麻省大学医学院的研究团队在《Brain Communications》发表重要成果。研究聚焦新开发的两种靶向HTT^1a C端83-90位表位(基于23Q的HTT序列)的单克隆抗体1B12和11G2，系统评估了其在Western blot检测中的应用价值。

关键技术方法包括：1)采用Q50-Q175全系列HD基因敲入小鼠及YAC128转基因小鼠脑组织样本；2)通过3-8% Tris-醋酸梯度胶电泳优化HTT^1a分离；3)建立smear定量分析方法；4)使用MSH3 siRNA处理Q111小鼠验证CAG重复扩展影响；5)免疫印迹与免疫沉淀平行比较实验。

研究结果

HTT^1a蛋白的亚细胞分布与年龄特征

在6月龄Q111小鼠纹状体中，1B12抗体检测到75kDa的HTT^1a主要存在于S1可溶组分，而高分子量smear则富集于P1核组分。随年龄增长，12-24周龄Q111小鼠的可溶性HTT^1a减少50%，smear显著增加。Q175和YAC128小鼠也呈现类似的年龄依赖性变化模式。

CAG重复长度决定分子特征

在6月龄HD基因敲入小鼠中，HTT^1a迁移速率与CAG重复数呈负相关：Q80(65kDa)→Q111(75kDa)→Q140(100kDa)→Q175(130kDa)。值得注意的是，HMM smear仅在CAG≥111的小鼠中出现，提示存在检测阈值。

MSH3沉默的治疗潜力

通过侧脑室注射MSH3-1000 siRNA使Q111小鼠纹状体MSH3蛋白降低>84%时，HTT^1a smear水平显著下降(p=0.0395)，且smear强度与MSH3水平呈正相关(R²=0.3033)。

抗体特异性验证

1B12/11G2的检测信号可被HTT^1a C端八肽(AEEPLHRP)阻断，而无关肽段无此效应。与S830和MW8抗体相比，1B12对HD基因敲入小鼠smear的检测灵敏度更高。

讨论与意义

该研究首次实现HD模型脑中HTT^1a的直接Western blot检测，揭示其存在形式受CAG重复数、年龄和亚细胞定位三重调控。特别重要的是，发现MSH3介导的CAG重复扩展与HTT^1a smear形成存在量化关联，为临床前研究提供新型生物标志物。虽然人类HD脑样本中未检测到特异性信号，可能源于神经元大量丢失或核内隔离，但建立的小鼠检测体系已具备三大优势：1)仅需微量组织；2)可同步分析可溶性与聚集态蛋白；3)支持治疗干预效果的定量评估。这些突破为开发靶向HTT^1a生成或聚集的HD治疗策略奠定重要方法学基础。