幽门螺杆菌磷酸泛酰巯基乙胺腺苷酰转移酶的结构解析与催化机制研究

研究人员针对幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)感染治疗中抗生素耐药性问题，聚焦其关键代谢酶磷酸泛酰巯基乙胺腺苷酰转移酶(PPAT)，通过X射线晶体学解析了apo形式及与ATP、Ppant、dPCoA的复合物结构，结合定点突变和动力学分析，揭示了物种特异性活性位点相互作用机制，为靶向药物设计奠定基础。

　　

幽门螺杆菌(H. pylori)感染是全球范围内导致慢性胃炎、消化性溃疡甚至胃癌的重要病因。尽管现有疗法以质子泵抑制剂联合抗生素为主，但日益严重的抗生素耐药性迫使科学家寻找新的药物靶点。细菌的辅酶A(CoA)生物合成通路因其在代谢中的核心作用成为潜在突破口，其中磷酸泛酰巯基乙胺腺苷酰转移酶(PPAT)催化CoA合成的倒数第二步反应，成为备受关注的抗菌靶标。

以往研究虽解析了大肠杆菌(E. coli)等细菌PPAT的结构，但幽门螺杆菌PPAT(HpPPAT)的底物结合特性和催化残基贡献仍不明确。特别值得注意的是，人类PPAT与细菌同源物结构差异显著，这为开发特异性抗菌药物提供了可能。然而，HpPPAT活性位点的物种特异性特征及其催化机制的系统研究尚属空白。

为回答这些问题，来自台湾清华大学生物信息与结构生物学研究所的I-Ting Ko、Hsien-Sheng Yin团队在《Bioscience Reports》发表了最新成果。研究综合运用X射线晶体学（解析1.98-2.12 ?分辨率结构）、定点突变（构建P8A等10个突变体）、酶动力学分析（测定k_cat/K_m等参数）和圆二色谱（验证蛋白折叠）等技术，首次揭示了HpPPAT的完整催化机制。

【整体结构】

研究解析了HpPPAT的apo结构及与ATP、4′-磷酸泛酰巯基乙胺(Ppant)的复合物，发现其单体由5个平行β链和6个α螺旋组成，形成典型的二核苷酸结合折叠。值得注意的是，ATP结合状态下HpPPAT形成十二聚体，而Ppant结合时呈现二聚体，这种寡聚状态变化与其他细菌PPAT存在显著差异。

【底物结合位点】

通过比较HpPPAT与大肠杆菌(EcPPAT)、粪肠球菌(EfPPAT)等复合物结构，发现HpPPAT利用Pro8、Lys42和Arg133进行ATP结合，这种模式在其他细菌PPAT中未见报道。特别发现Ser128和Ser129通过水分子介导的氢键网络稳定ATP的γ-和β-磷酸基团，而Arg133直接与γ-磷酸基团作用，替代了EcPPAT中Ser130的功能。

【突变体分析】

动力学研究表明，Thr10、Lys42突变仅降低催化效率（k_cat/K_m降至野生型的25-30%），而His18、Arg88等突变则完全丧失活性。圆二色谱证实突变未破坏蛋白折叠，说明活性丧失源于催化功能缺陷而非结构紊乱。特别发现P8A突变体在逆反应中表现出增强的ATP生成能力，提示该残基可能影响dPCoA利用效率。

【催化机制】

研究整合结构生物学与生化数据，提出HpPPAT遵循"在线置换"机制：Thr10和Lys42协同定向Ppant的4′-磷酸基团作为亲核试剂，攻击ATP的α-磷酸基团，His18稳定过渡态，Mg²⁺虽未在晶体中观测但对催化不可或缺。Arg88的双重氢键对磷酸基团定向至关重要，这解释了其突变导致完全失活的原因。

这项研究首次在原子水平阐明了HpPPAT的催化机制，揭示了与EcPPAT等细菌同源物的关键差异：独特的ATP结合模式（依赖Pro8/Arg133）、差异化的磷酸基团稳定方式（水介导网络与直接作用并存），以及pH依赖的dPCoA结合特性（pH 7.4时全位点结合）。这些发现不仅丰富了核苷酸转移酶超家族的催化理论，更为设计针对H. pylori感染的特异性PPAT抑制剂提供了结构基础。鉴于HpPPAT活性位点与人类同源物的显著差异，针对其关键残基（如Arg88、His18）开发的抑制剂有望成为克服抗生素耐药性的新一代抗菌药物。