ProtacID技术：活细胞中PROTAC邻近蛋白鉴定的革命性方法及其在靶向蛋白降解领域的应用

本研究针对PROTAC（蛋白降解靶向嵌合体）开发中特异性验证的难题，开发了基于BioID（邻近依赖性生物素化）的ProtacID技术。该技术能在活细胞中鉴定PROTAC邻近蛋白，成功区分 productive（可降解）与 non-productive（非降解）相互作用，并应用于染色质、膜蛋白等多类靶点。研究为PROTAC开发提供了关键工具，相关成果发表于《Nature Communications》。

　　

在当今药物研发领域，靶向蛋白降解（Targeted Protein Degradation, TPD）技术因其能靶向传统“不可成药”蛋白而备受瞩目。其中，PROTAC（PROteolysis TArgeting Chimeras）作为双功能分子，通过同时结合靶蛋白和E3泛素连接酶（如VHL或CRBN），诱导靶蛋白泛素化降解。然而，现有技术难以在活细胞中全面鉴定PROTAC的直接作用靶点及非降解性相互作用，这严重制约了PROTAC的精准开发。

为解决这一瓶颈，由Suman Shrestha、Brian Raught等团队在《Nature Communications》发表的研究，开发了名为ProtacID的创新技术。该技术将迷你Turbo生物素连接酶（miniTurbo）与E3连接酶（VHL或CRBN^mdi）融合，通过邻近标记策略捕获PROTAC邻近的蛋白质网络。研究首次实现了对PROTAC作用靶点的活细胞验证，并揭示了传统蛋白质组学无法检测的非降解性相互作用，为TPD领域提供了重要方法论突破。

关键技术方法

研究团队通过以下核心实验体系实现目标：

1. 1.

   构建稳定表达FLAG-miniTurbo-VHL/CRBN^mdi融合蛋白的Flp-In细胞系（包括HEK293、697白血病细胞等6种人源细胞）；

2. 2.

   联合使用PROTAC处理与neddylation抑制剂MLN4924（阻断靶蛋白降解）；

3. 3.

   基于链霉亲和素珠的亲和纯化与质谱分析，结合SAINTexpress算法筛选高置信度互作蛋白；

4. 4.

   通过Western blot和免疫荧光验证关键发现。

研究结果

ProtacID工具开发

通过测试不同VHL-miniTurbo融合构型（如全长VHL与ΔVHL变体），发现ΔVHL-C端融合miniTurbo的版本效率最高。在BAF复合物靶向PROTAC ACBI1处理中，该工具成功捕获了SMARCA2/4、PBRM1等22个BAF亚基，与标准BioID结果高度一致（图2d）。

区分BAF复合物亚型

针对靶向不同BAF亚型的PROTAC（如PBAF特异性PROTAC VZI85），ProtacID仅检测到BRD7/9等亚型特异性组分，而cBAF特有蛋白ARID1A/B未被捕获（图3），证明其分辨相近蛋白复合物的能力。

跨细胞系应用验证

在697白血病细胞、HAP1基因敲除细胞等模型中，ProtacID数据与293细胞高度一致。例如，HAP1 SMARCA2敲除细胞中，SMARCA2相关信号完全消失（图3），证实技术的可重复性与遗传背景适应性。

非降解相互作用的发现

全局蛋白质组学未检测到的驱动蛋白KIF20B，被ProtacID鉴定为ACBI1的非降解性结合靶点（图4a）。该发现通过剂量依赖性生物素化实验（图4b）和MLN4924处理对照（图4d）得到验证，揭示了PROTAC可能存在的脱靶效应。

膜蛋白靶点应用

在EGFR^L858R突变型非小细胞肺癌细胞（HCC827/NCI-H3255）中，无核定位信号的FmT-ΔVHL成功捕获膜定位EGFR及其互作蛋白（图6b），拓展了技术适用范围。

结论与意义

本研究建立的ProtacID技术突破了PROTAC开发中的三大核心挑战：

1. 1.

   直接验证降解靶点，避免传统蛋白质组学的间接推断误差；

2. 2.

   首次系统鉴定非降解性相互作用（如KIF20B），为评估PROTAC副作用提供新维度；

3. 3.

   无需抗体或基因修饰即可分析内源蛋白复合物，适用于突变体功能研究。

该技术可进一步拓展至MDM2、DCAF16等E3连接酶体系，其“双模式”设计（图4e）既能全面分析PROTAC相互作用组，也能特异性筛选非降解靶点，为TPD药物的临床前评估建立了新标准。