模块化多酶级联系统实现甘油绿色可持续合成非天然氨基酸

本研究针对非天然氨基酸(ncAAs)工业化生产存在的效率低、成本高、环境负担重等问题，开发了基于O-磷酸-L-丝氨酸硫化酶(OPSS)的模块化多酶级联平台。研究人员通过定向进化将OPSS催化C-N键形成的效率提升5.6倍，利用生物柴油副产物甘油为底物，在2升反应体系中实现22种含C-S/C-Se/C-N侧链ncAAs的克级至十克级合成，原子经济性>75%且仅产生水副产物，为药物开发和生物材料领域提供了绿色高效的合成工具。

　　

在生命科学和医药研发领域，非天然氨基酸(ncAAs)因其独特的化学基团成为拓展蛋白质功能的重要工具。这些分子可赋予生物大分子特殊性质，在药物设计(如HIV蛋白酶抑制剂奈非那韦前体)、抗癌药物开发(如Eg5驱动蛋白抑制剂)和生物材料创新中具有巨大潜力。然而传统化学合成法面临立体选择性差、重金属污染等问题，而现有酶催化体系又受限于底物范围窄、热力学平衡限制等瓶颈。如何建立绿色高效、可工业放大的ncAAs合成平台，成为制约该领域发展的关键难题。

《Nature Communications》最新发表的研究通过创新性的多酶级联设计，将生物柴油工业的废弃甘油转化为高价值ncAAs。该工作主要采用四大关键技术：(1)基于AlphaFold3的蛋白结构预测与分子对接指导酶改造；(2)定向进化获得催化效率提升5.6倍的OPSS突变体(AsOPSS^T200F/F144Y)；(3)模块化组装甘油氧化、磷酸化及转氨反应通路；(4)200升规模的多酶反应体系优化。研究团队还利用100纳秒分子动力学(MD)模拟解析了突变体稳定底物结合的分子机制。

酶促亲核取代反应发现与酶元件筛选

通过比较三种O-磷酸-L-丝氨酸硫化酶(OPSS)与传统半胱氨酸合成酶CysM/CysK的活性，发现来自古菌的AsOPSS对烯丙硫醇(1a)、苯硫酚(1b)和1,2,4-三唑(2a)等差异显著的亲核试剂均展现更优催化活性，其中对2a的催化效率比CysM高三个数量级。

模块化多酶级联系统设计

创新性地将反应分为三个模块：模块I通过热稳定突变体TfAldO^mut将甘油氧化为D-甘油酸；模块II通过ScG3K/EcPGDH/AbPSAT酶组合实现磷酸化及转氨生成OPS；模块III采用"即插即用"策略，通过野生型AsOPSS或其突变体催化22种亲核试剂与OPS反应。该系统ΔG°为负值，证实热力学可行性。

AsOPSS底物谱拓展与活性提升

分子对接锁定α-氨基丙烯酸中间体6?范围内的14个残基进行饱和突变，获得对吡唑(2b)活性提升5.6倍的双突变体AsOPSS^T200F/F144Y。MD模拟显示突变通过增加氢键网络稳定亲核试剂结合，使C-N键形成距离在100ns模拟中保持稳定。

规模化生产优化与应用验证

在20mM Mg²⁺和15mM多磷酸盐条件下，优化酶比例使D-甘油酸产量达19.3mM。以150mM甘油为底物，成功制备10克级S-苯基-L-半胱氨酸(3b)等6种具有药效的ncAAs，其中3b可一步转化为强效犬尿氨酸酶抑制剂S-苯基-L-半胱氨酸S,S-二氧化物。成本分析显示该平台生产3b仅需市场价50%的成本。

这项研究开创性地建立了从工业废弃物到高值ncAAs的绿色合成路径，解决了传统方法原子经济性差、环境负担重的核心问题。通过理性设计的多酶模块协同作用，不仅实现了含硫、硒、氮杂环等22种ncAAs的高效制备，更通过定向进化突破C-N键形成的酶催化瓶颈。该平台水作为唯一副产物、>75%原子经济性的特性，完美契合联合国2030可持续发展目标，为生物制造领域提供了可放大的技术范式。特别值得注意的是，研究中开发的即插即用模块可灵活适配不同亲核试剂，这种通用性设计思路为其他高值化学品的生物合成提供了重要参考。