酿酒酵母中肠球菌素A的高效表达与活性优化：解决IIa类细菌素生产瓶颈的新策略

本研究针对IIa类细菌素大规模生产受限的问题，通过比较酿酒酵母(S. cerevisiae)表达系统中肠球菌素A(EntA_Opt)、植物乳杆菌素423(PlaX_Opt)和蒙氏肠球菌素ST4SA(MunX_Opt)的异源表达。研究发现EntA_Opt产量达50.93 mg/L，活性显著优于其他两种细菌素，并通过LC-MS/MS揭示了二硫键构象与翻译后修饰对活性的关键影响。该研究为食品工业和医疗领域提供了高效的细菌素生产平台，发表于《Probiotics and Antimicrobial Proteins》。

　　

在食品安全和医疗健康领域，IIa类细菌素因其对单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)等食源性病原体的强效抑制作用而备受关注。这类由乳酸菌产生的抗菌肽虽已获GRAS(公认安全)认证，但其工业化生产仍面临两大瓶颈：天然宿主产量低下(受严格调控)和复杂培养基导致的纯化困难。更棘手的是，像肠球菌素A(enterocin A)这样的明星分子，其活性高度依赖两对二硫键的正确形成，而天然操纵子中却缺乏辅助蛋白基因，使得异源表达系统面临巨大挑战。

为突破这一困境，Michelle Rossouw团队在《Probiotics and Antimicrobial Proteins》发表的研究中，创新性地利用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)表达系统，对肠球菌素A(EntA_Opt)进行密码子优化表达，并与先前已成功表达的植物乳杆菌素423(PlaX_Opt)和蒙氏肠球菌素ST4SA(MunX_Opt)进行系统性比较。这项研究不仅揭示了二硫键辅助蛋白对肽活性的关键影响，更开发出高效的细菌素生产平台，为食品防腐和抗感染治疗提供了新思路。

研究团队运用了以下关键技术：1)基因优化技术提升CBI(密码子偏性指数)和CAI(密码子适应指数)；2)酵母介导的克隆(YML)构建重组质粒；3)高效液相色谱(HPLC)纯化活性肽；4)纳米液相色谱-串联质谱(nano-LC-MS/MS)解析翻译后修饰；5)生物反应器批式和补料分批培养工艺优化。所有实验均以单核细胞增生李斯特菌EDG-e为指示菌株进行活性验证。

Expression of Enterocin A in Saccharomyces cerevisiae

通过密码子优化将entA基因的CBI从0.07提升至0.48，构建Y294[EntA_Opt]工程菌株。摇瓶培养显示EntA_Opt产量(50.93 mg/L)是PlaX_Opt的2.77倍，抑菌活性达192.74 nM，且不影响宿主生长。电泳分析确认4.8 kDa目标条带，活性验证显示其抑制圈直径达40.33 mm。

Characterisation of Peptides Produced in Shake Flasks

HPLC纯化后质谱分析发现：MunX_Opt存在棕榈酸(C16)等脂肪酸修饰；PlaX_Opt呈现三种二硫键构象(Cys1-Cys2/Cys3-Cys4、Cys1-Cys3/Cys2-Cys4、Cys1-Cys4/Cys2-Cys3)，其中第一种构象活性最高；EntA_Opt虽也有多种构象，但正确折叠比例显著更高，这解释了其6.14倍于PlaX_Opt的活性优势。

Peptide Production in Bioreactors

生物反应器优化使EntA_Opt产量提升68%：1)批式培养24小时产77.22 mg/L，葡萄糖转化率达4.32 mg/g；2)补料分批培养14小时即达85.77 mg/L，但成本较高。代谢分析显示酵母能有效利用乙醇进行二次生长，避免了"克雷布特里效应"。

这项研究的重要发现在于：首次证实酿酒酵母无需辅助蛋白即可高效表达具有正确二硫键的EntA_Opt，其产量和活性均创同类研究新高。特别值得注意的是，通过质谱解析了不同细菌素的修饰谱：甲基丙二酰化、琥珀酰化等修饰虽普遍存在，但仅当二硫键构象正确时才保持高活性。对于缺乏PlaC辅助蛋白的PlaX_Opt，错误折叠导致活性降低，这为后续工程改造指明了方向——共表达PDI(蛋白二硫键异构酶)或引入天然辅助基因。

该研究的产业化价值尤为突出：1)建立的酵母生产系统比大肠杆菌体系产量提高4倍；2)开发的生物反应器工艺使生产率达6.13 mg/L/h；3)明确了培养基组分对产物活性的影响，为下游纯化提供依据。这些突破不仅解决了IIa类细菌素的生产瓶颈，更为其他复杂二硫键肽类的异源表达提供了范本。未来可进一步探索脂肪酸修饰对活性的调控机制，推动抗菌肽在功能性食品和抗感染药物中的应用。