基于可变剪接生物标志物的复发缓解型多发性硬化症稳健多基因分类器的构建与验证

本研究针对多发性硬化症(MS)缺乏血液诊断标志物的临床难题，通过分析外周血中IFNAR2、NFAT5和PRKCA基因的可变剪接(AS)事件，开发出MS-Splicing Score (MS-SS)分类器。研究在意大利和美国队列验证显示AUC达0.71-0.77，经PCA优化后AUC提升至0.87，为神经免疫疾病提供了新型转录组学生物标志物开发策略。

　　

多发性硬化症(MS)是一种以中枢神经系统炎性脱髓鞘为特征的复杂疾病，其诊断主要依赖临床表现和MRI检查，缺乏可靠的血液生物标志物。近年来，可变剪接(Alternative Splicing, AS)作为基因表达调控的关键机制，在MS发病中的作用日益受到关注。研究表明，超过95%的人类多外显子基因存在AS现象，这种机制通过产生不同的mRNA异构体显著增加蛋白质组的多样性。在免疫系统中，AS参与调控T细胞活化、迁移、细胞因子反应和凋亡等重要过程。MS患者的全基因组研究已发现明显的剪接模式改变，包括RNA加工缺陷和差异外显子使用，这些异常可能通过产生新的自身抗原表位或破坏免疫调节参与疾病发生。

目前MS临床实践中使用的生物标志物主要包括MRI特征、脑脊液寡克隆带(OCB)和血清神经丝轻链(NfL)，但尚无类似类风湿关节炎中类风湿因子(RF)和抗环瓜氨酸肽抗体(ACPA)的血液诊断检测。因此，开发基于外周血的可重复、可靠的AS生物标志物具有重要临床价值。

在这项发表于《Journal of Trace Elements and Minerals》的研究中，Federica Airi等研究人员旨在构建和验证一个基于AS的多变量分类器(MS-Splicing Score, MS-SS)，用于区分复发缓解型MS(RRMS)患者和健康对照。研究团队选择了三个功能相关且有文献支持的AS事件：IFNAR2外显子8跳过、NFAT5外显子2跳过和PRKCA非经典外显子3*的异常包含。通过荧光竞争性RT-PCR技术定量检测了两个独立队列(意大利：37例RRMS，50例对照；美国：29例RRMS，20例对照)外周血RNA中的这些异构体。

关键技术方法包括：1)使用荧光竞争性RT-PCR定量AS事件；2)通过逻辑回归模型训练得到MS-SS；3)ROC曲线分析评估分类性能；4)应用主成分分析(PCA)和线性判别分析(LDA)进行数据降维；5)采用逻辑学习机(LLM)算法进行基于规则的建模。

研究结果部分：

"Selection of AS events for the construction of a MS splicing score"

研究人员基于四个标准筛选出三个AS事件：实验验证的剪接改变、文献报道的MS相关改变、推测的免疫/CNS机制影响，以及公共数据库注释。IFNAR2外显子8跳过影响干扰素信号，NFAT5外显子2跳过与T细胞调节相关，PRKCA外显子3*异常包含可能改变激酶结构域。

"Initial evaluation of AS events in the Italian cohort"

在意大利队列中，RRMS患者三个基因的异常异构体表达均高于对照，其中NFAT5达到显著差异(p=0.031)，IFNAR2和PRKCA呈边缘显著(p=0.077)。

"MS-SS discriminates MS Cases from controls in the Italian Cohort"

逻辑回归构建的MS-SS在意大利队列中显著区分病例与对照(p=0.00083)，AUC为0.71(95%CI:0.59-0.82)，最佳cutoff灵敏度59%，特异性80%。

"The MS-SS retains discriminatory power in an independent US cohort"

在美国验证队列中，MS-SS保持显著区分能力(p=0.00074)，AUC提升至0.77(95%CI:0.63-0.90)，其中IFNAR2贡献最大(p=0.00057)。

"Refined MS-SS via PCA on the pooled cohort demonstrates superior classification of MS Cases"

合并队列分析显示MS-SS AUC为0.72，经PCA处理后第一主成分(PC1)的区分能力显著提高(p=5.7×10^-14)，AUC达0.87(95%CI:0.81-0.94)，灵敏度80%，特异性86%。

"LLM-based modeling of exon splicing thresholds reveals discriminative signatures for MS"

LLM建模发现PRKCA psi>0.067和IFNAR2 psi>0.465组合可100%准确识别部分MS病例，据此开发的规则评分算法将受试者分为"可能MS"、"可能对照"和"不确定"三类。

讨论部分指出，MS-SS不仅具有诊断价值，其包含的AS事件还提供了MS发病机制的见解。IFNAR2外显子8跳过可能产生功能异常的干扰素受体，NFAT5剪接变异影响渗透压调节和T细胞活化，PRKCA异构体改变可能影响免疫反应和突触可塑性。值得注意的是，PRKCA rs35476409/rs61762387单核苷酸多态性(sQTL)可能导致其在欧美人群中的表现差异，提示生物标志物开发需考虑群体遗传变异。

这项研究的创新点在于首次将多个AS事件整合为MS诊断评分，并通过PCA优化显著提高了分类准确性。基于LLM的规则建模为临床转化提供了可行路径。局限性包括样本量较小和缺乏蛋白水平验证。未来需要在更大队列中验证，并探索其在疾病监测和治疗反应预测中的应用。该研究为神经免疫疾病的转录组学生物标志物开发提供了新思路，有望弥补当前MS血液诊断标志物的空白。