花椒胶孢炭疽病菌(Fusarium tricinctum)分子检测技术体系的建立与评价：基于LAMP、巢式PCR和实时荧光定量PCR的比较研究

本研究针对花椒树胶孢炭疽病潜伏期长、传统检测方法效率低下的问题，开发了基于CYP51C基因的LAMP、巢式PCR和qPCR三种分子检测技术。结果表明，qPCR灵敏度最高(3.1 fg/μL)，巢式PCR稳定性最佳，而LAMP凭借快速(50分钟)、可视化(HNB显色)和低成本优势，成为田间检测的理想选择，为花椒病害早期防控提供了关键技术支撑。

　　

花椒作为中国重要的经济树种，其果皮是著名的香料"花椒"，种子可榨油，还具有抗炎、抗氧化等多种药理活性。然而近年来，由胶孢炭疽菌(Fusarium tricinctum)引起的花椒流胶病在四川、甘肃等地肆虐，造成严重经济损失。这种病害潜伏期长、早期症状不典型，传统依靠形态学观察和常规PCR的检测方法既耗时(需5天培养)又难以早期诊断，往往错过最佳防治时机。

为突破这一技术瓶颈，四川农业大学的Dong Yuqing团队在《BMC Microbiology》发表研究，首次系统开发并比较了三种分子检测技术。研究人员从四川汉源县发病花椒枝条中分离获得F. tricinctum病原菌，通过多基因(ITS、TEF1-α、LSU)系统发育分析确认其分类地位。针对该菌特有的CYP51C基因(甾醇14α-脱甲基酶基因)，设计特异性引物，分别建立了环介导等温扩增(LAMP)、巢式PCR和实时荧光定量PCR(qPCR)检测体系。研究还采用人工接种实验验证方法的实用性，并通过与15种相关真菌的交叉反应测试验证特异性。

主要技术方法

研究首先通过组织分离法获得纯化菌株，采用通用引物扩增ITS、TEF1-α和LSU基因进行分子鉴定。针对CYP51C基因保守区域，使用Primer Explorer V5设计LAMP引物(F3/B3、FIP/BIP)，通过优化Mg²⁺浓度(8.0 mM)、dNTPs(1.6 mM)等参数建立25μL反应体系。巢式PCR采用两轮扩增，外引物CYP-4F/R和内引物C4-10F/R分别在56°C和53°C退火温度下运行。qPCR采用SYBR Green I荧光染料，构建1.52×10¹⁰ copies/μL的质粒标准品生成标准曲线(y=-3.48x+48.45，R²=0.9969)。

特异性检测

三种方法在测试15种真菌时均仅对F. tricinctum产生特异性信号。LAMP在65°C孵育50分钟后，通过羟基萘酚蓝(HNB)颜色变化即可肉眼判读结果，其引物浓度优化为内外引物比1:8(0.8μM:0.1μM)。

灵敏度比较

qPCR表现最优，检测限达3.1 fg/μL，比常规PCR敏感1000倍。巢式PCR和LAMP均为31 fg/μL，而常规PCR仅3.1 pg/μL。在接种花椒样品中，qPCR仍保持320 fg/μL的高灵敏度。

田间验证

人工接种5天后，三种方法均能从发病组织检出病原菌。LAMP凭借无需复杂仪器的优势，在60分钟内完成检测，且通过HNB显色可直接田间判读。

该研究首次建立了花椒胶孢炭疽菌的多层次分子检测技术体系。其中LAMP技术突破实验室条件限制，实现"肉眼可视、现场出结果"的革新性诊断；qPCR为病原菌定量监测提供精准工具；巢式PCR则展现出优异的稳定性。这些技术不仅解决了花椒流胶病早期诊断难题，其基于CYP51C基因的设计策略更为其他植物真菌病害检测提供范式。正如作者指出，这项成果将直接服务于我国花椒主产区的病害防控实践，对保障特色经济作物安全生产具有重要意义。