基于中生霉素的新型转化系统在米曲霉和黑曲霉中的开发与应用

为解决丝状真菌遗传操作中高效抗性转化系统缺乏的难题，研究人员开发了基于中生霉素(zhongshengmycin)和诺尔丝菌素乙酰转移酶(NAT)的新型转化系统。通过SDS和EDTA-Na2预处理破坏细胞膜完整性，显著提高了米曲霉(Aspergillus oryzae)和黑曲霉(Aspergillus niger)对抗生素的敏感性。研究实现了attB/attP介导的β-葡萄糖醛酸酶在米曲霉中的异源表达（选择效率85.71%）以及megfp-sed5在黑曲霉中的重组（转化效率83.33%），为真菌生物技术提供了经济高效的转化平台。

　　

在食品工业和生物技术领域，米曲霉(Aspergillus oryzae)和黑曲霉(Aspergillus niger)作为重要的微生物细胞工厂，被广泛应用于酱油发酵、蛋白酶生产和柠檬酸合成等过程。然而，这些丝状真菌的遗传操作长期面临两大瓶颈：一是传统转化效率低下（仅10^2-3转化子/μg DNA），远低于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的10^6-8转化子/μg DNA；二是缺乏经济高效的选择标记，现有抗性标记如潮霉素(hph)和G418对米曲霉效果不佳，而营养缺陷型标记(pyrG/amdS)无法用于野生型菌株。更棘手的是，工业菌株往往对多种抗生素具有天然抗性，这严重制约了合成生物学技术在真菌代谢工程中的应用。

针对这一挑战，华南理工大学的Futi Bi、Qichen Huang等研究人员独辟蹊径，将中国农业科学院发现的中生霉素(zhongshengmycin)——一种价格仅为诺尔丝菌素(nourseothricin)1/3379的链丝菌素类抗生素——引入真菌遗传操作系统。通过创新性地联合使用表面活性剂SDS和金属螯合剂EDTA-Na₂破坏细胞膜完整性，成功突破了米曲霉对中生霉素的天然抗性屏障。相关研究成果发表在《Systematic and Applied Microbiology》上，为丝状真菌的基因操作提供了全新解决方案。

研究团队采用了多项关键技术：首先通过PEG介导的原生质体转化法将携带诺尔丝菌素乙酰转移酶(NAT)基因的质粒导入真菌；利用attB/attP位点特异性重组系统实现基因精准整合；采用X-Gluc显色法检测β-葡萄糖醛酸酶(GUS)活性；通过荧光显微镜观察Megfp-Sed5标记的高尔基体定位；比较了zhongshengmycin/NAT系统与传统PyrG系统的转化效率。实验菌株包括米曲霉IFO4177、3.042、RIB40和黑曲霉CBS513.88ΔkusA等工业常用菌株。

3.1 化学试剂增强真菌对抗生素敏感性

研究发现0.05 g/L SDS联合960 μg/mL中生霉素可完全抑制米曲霉IFO4177生长，而工业菌株3.042需要额外添加1.5 mM EDTA-Na₂才能达到相同效果。对于黑曲霉，0.01 g/L SDS或0.1 mM EDTA-Na₂能使中生霉素有效浓度从60 μg/mL降至30 μg/mL。有趣的是，传统增强剂TritonX-100和氯丙嗪(chlorpromazine)反而会降低黑曲霉的敏感性。

3.4 米曲霉基因编辑新突破

通过将NAT抗性基因与GUS报告基因共转化，在含960 μg/mL中生霉素的筛选平板上获得37个转化子。PCR验证显示6/7的克隆实现正确整合，X-Gluc显色证实了功能性β-葡萄糖醛酸酶的表达。结构分析揭示NAT属于RimI超家族，通过乙酰化β-氨基使链丝菌素类抗生素失活。

3.5 黑曲霉高效转化系统

在黑曲霉中比较zhongshengmycin/NAT与PyrG系统，发现两者转化效率相当（83.33% vs 常规）。荧光定位显示Megfp-Sed5融合蛋白定位于内质网出口附近，且布雷菲德菌素(BFA)处理未改变高尔基体结构分布，暗示分泌抑制剂可能通过功能而非结构途径发挥作用。

这项研究的意义在于：经济性方面，中生霉素成本仅为常用抗生素的1/72，大幅降低研究门槛；技术层面，建立的不依赖营养缺陷型的转化系统可直接用于野生菌株改造；应用价值上，85.71%的阳性筛选率为代谢工程提供了高效工具。研究者特别指出，该系统中SDS和EDTA-Na₂的协同作用机制可能为其他难转化微生物提供借鉴。专利ZL202510041565.2已覆盖该技术，为工业菌株改造开辟了新途径。未来可进一步优化试剂组合，拓展至青霉(Penicillium)等更多丝状真菌体系。