"TadA-NW1：一种新型腺嘌呤碱基编辑器实现精准基因组编辑并有效降低旁观编辑效应"

本研究针对现有碱基编辑器(ABE)活性窗口过宽导致的旁观编辑问题，开发了整合天然寡核苷酸结合模块的TadA-NW1变体。通过结构引导的蛋白质工程策略，研究人员成功将ABE-NW1的编辑窗口从10bp缩小至4bp，在囊性纤维化(CF)细胞模型中精准修复CFTR W1282X突变的同时显著降低非靶标编辑。该成果为遗传病治疗提供了更安全的基因编辑工具，发表于《Nature Communications》。

　　

基因组编辑技术为遗传病治疗带来了革命性突破，但现有碱基编辑器存在"活性窗口过宽"的致命缺陷——当靶位点附近存在多个可编辑碱基时，会引发非目标位点的"旁观编辑"。以囊性纤维化(CF)为例，82.3%可通过腺嘌呤碱基编辑器(ABE)修复的致病突变都位于多腺嘌呤区域，这使得传统ABE8e在修复CFTR W1282X突变时，会同时产生可能影响蛋白质功能的R1283G突变。如何实现"精准点射"式的单碱基编辑，成为基因治疗领域亟待解决的关键难题。

研究团队创新性地从天然RNA结合蛋白中获得灵感。通过分析人类Pumilio蛋白的RNA识别机制，发现其通过芳香族氨基酸的堆叠作用和氢键网络实现核酸特异性识别。基于此，他们将N108Q/M151C/Q154Y突变引入当前最高效的腺嘌呤脱氨酶TadA-8e活性中心，构建出TadA-NW系列变体。当与Cas9切口酶融合后，ABE-NW1在HEK293T细胞中展现出惊人的特异性：编辑窗口从ABE8e的10bp(protospacer位置3-12)压缩至4bp(位置4-7)，目标位点与旁观位点的编辑比最高提升175倍。

关键技术包括：1)基于结构的蛋白质工程改造TadA脱氨酶；2)靶向扩增子高通量测序定量编辑效率；3)全基因组测序评估脱靶效应；4)囊性纤维化患者来源的支气管上皮细胞模型验证治疗潜力。

A streamlined base editor engineering strategy to reduce bystander editing

通过结构分析发现，DNA非靶链在脱氨酶活性中心的U型构象是导致旁观编辑的结构基础。研究人员在TadA-8e底物结合口袋引入芳香族残基，形成额外的碱基堆叠和静电相互作用，成功稳定了底物构象。

Development of a structure-guided protein re-engineering strategy to narrow the base editing window

设计的TadA-NW变体使ABE-NW在HEK293T细胞中保持A5和A7位点的峰值编辑效率(约60%)，同时将A3和A9位点的旁观编辑分别降低15.2倍和20.3倍。通过定义20%的编辑比率阈值，最终优选ABE-NW1和ABE-NW2进行后续研究。

Characterization of TadA-NW-derived ABE variants

在9个内源基因组位点测试中，ABE-NW1在7个位点保持与ABE8e相当的编辑效率，同时显著减少A2-A3和A8-A12位点的旁观编辑。删除TadA-NW1与Cas9切口酶之间的柔性 linker 构建的ABE-NW1-NL变体，进一步将目标/旁观编辑比提高至ABE8e的175倍。

Expanding the targeting and editing scopes of TadA-NW1

当与识别NG PAM的NG-Cas9或识别NGA PAM的VRQR-Cas9变体融合时，ABE-NW1保持90%以上的目标编辑效率，同时将非目标编辑降低31.8倍。该变体还可重编程为胞嘧啶脱氨酶(Td-CBE-NW)和腺嘌呤颠换编辑器(ACBE-NW)，分别实现C·G-to-T·A和A·T-to-C·G的精准编辑。

DNA off-target editing analysis of ABE-NW1

正交R-loop实验显示ABE-NW1的Cas9非依赖性脱靶编辑率(0.0561%)显著低于ABE8e(0.855%)。全基因组测序证实新型脱靶突变仅13个，且经Sanger测序验证均为假阳性。

Therapeutic application of ABE-NW1 in correcting a cystic fibrosis cell model

在CFTR W1282X突变的支气管上皮细胞中，ABE-NW1通过识别非经典GAG PAM实现54.2%的目标编辑，完美校正等位基因占比达36.6%(较ABE8e提高6.21倍)，同时将R1283G有害突变从61.9%降至20.4%。Western blot显示ABE-NW1处理组的CFTR蛋白表达恢复至野生型的46.1%，显著优于ABE8e组。

这项研究开创性地将天然核酸结合模块整合到碱基编辑器中，不仅解决了长期困扰基因治疗的旁观编辑难题，更为蛋白质工程提供了可推广的设计范式。特别值得注意的是，ABE-NW1在囊性纤维化治疗模型中展现的精准编辑能力，为80.5%尚无治疗方案的CFTR突变患者带来了新希望。该成果发表于《Nature Communications》，标志着精准基因组编辑向临床转化迈出了关键一步。