深度缺失突变揭示外显子剪接调控的棋盘式架构及反义寡核苷酸设计新策略

本研究针对人类外显子剪接调控机制不清、反义寡核苷酸(AON)设计效率低的问题，通过深度缺失突变技术(DIM)系统解析FAS外显子6的剪接调控网络。研究发现外显子存在交替排列的增强子/沉默子"棋盘式"结构，揭示了U2 snRNP识别跨膜结构域编码外显子的新型抑制机制，并开发了基因组资源DANGO用于预测AON效应。该研究为剪接相关疾病治疗提供了新靶点和工具。

　　

在真核生物基因表达过程中，前体mRNA剪接是决定蛋白质多样性的关键环节。然而，人类外显子的调控架构仍如"黑箱"般神秘，特别是插入缺失突变(indels)对剪接的影响长期缺乏系统研究。更棘手的是，虽然反义寡核苷酸(AON)已成为治疗脊髓性肌萎缩症等剪接相关疾病的有力武器，但由于调控元件定位不清，AON设计仍依赖耗时费力的试错法。这些瓶颈严重制约了精准剪接调控在临床中的应用。

为破解这些难题，Pablo Baeza-Centurion团队在《Nature Communications》发表了突破性研究。研究人员选择FAS外显子6作为模型，该外显子编码的跨膜结构域决定细胞凋亡受体的功能转换。通过构建包含2010种缺失突变和5208种插入突变的文库，结合高通量剪接检测技术，首次绘制了外显子剪接调控的全景图谱。

关键技术包括：1) 设计覆盖所有可能indels的突变文库；2) 基于HEK293细胞转染和RT-PCR的高通量剪接检测；3) 利用SpliceAI算法预测全基因组外显子调控架构；4) 通过体外剪接体组装实验验证U2 snRNP结合机制；5) 整合GTEx数据库分析跨物种保守性。

深度indel突变揭示外显子剪接调控规律

研究发现61.3%的单核苷酸插入可改变剪接效率，且插入富含嘌呤的三联体(如GAG)普遍促进外显子纳入。更惊人的是，在FAS外显子6中央的嘧啶富集区插入AG可激活隐蔽剪接位点，产生新型微外显子，这一现象在神经元特异性剪接因子SRRM4过表达时增强。

U2 snRNP介导跨膜外显子抑制的新机制

研究首次发现U2 snRNP能识别外显子内的分支点样序列(CUAACU)，这种异常结合会竞争性抑制正常剪接。实验证实突变该序列可使外显子纳入率从45%升至75%。基因组分析显示23%的人类外显子含有类似序列，且在跨膜结构域编码外显子中富集，这为理解可溶性/膜结合蛋白亚型的平衡调控提供了新视角。

棋盘式调控架构的发现

系统缺失扫描揭示外显子存在交替排列的增强子(8-18nt)和沉默子(25-40nt)，形成独特的"棋盘式"结构。机器学习分析18,551个人类外显子发现，短外显子(<100nt)的调控元件密度显著更高(平均每100nt含3.7个转换)，而高纳入外显子则保持简单架构(仅1.5个转换)。

DANGO助力AON设计革新

研究团队开发的计算资源DANGO，通过预测21nt缺失的剪接效应来指导AON设计。实验验证显示AON效应与对应区域缺失突变高度相关(rho=0.75)。该工具特别适用于短外显子，其中44.8%的21nt缺失会产生显著剪接改变，为罕见病治疗提供了精准设计蓝图。

这项研究不仅揭示了外显子剪接调控的分子密码，更建立了从基础发现到临床应用的桥梁。发现的"棋盘式"调控规律为理解复杂疾病相关突变提供了新框架，而DANGO资源将大幅加速剪接调控疗法的开发进程。特别值得注意的是，U2 snRNP外显子识别机制的发现，可能为神经系统疾病中微外显子失调提供新的解释，展现了基础研究转化医学的巨大潜力。