胆固醇通过共同结合位点差异调节阿片受体和毒蕈碱受体的活性机制研究

本研究揭示了胆固醇通过非经典结合位点TM6上的R6.35残基差异调控G蛋白偶联受体（GPCR）家族中阿片受体与毒蕈碱受体活性的分子机制。研究人员采用分子动力学模拟结合功能实验，发现胆固醇在两类受体中共享的TM6-TM7沟槽结合位点，并通过精氨酸残基氢键作用实现受体构象特异性调控：抑制毒蕈碱受体而激活阿片受体信号。该发现为基于膜胆固醇微环境差异的靶向药物设计提供了新思路，相关成果发表于《Biochemical Pharmacology》。

　　

在生命活动的精密调控中，G蛋白偶联受体（GPCR）如同细胞膜上的"分子天线"，负责接收外界信号并触发级联反应。作为药物研发的"明星靶点"，GPCR家族中约30%的成员已被开发为临床药物靶标。然而，这些受体在细胞膜脂质环境中的行为仍充满谜团——特别是胆固醇分子如何像"变构魔术师"般精细调控不同受体的活性状态。

传统观点认为胆固醇通过CRAC（胆固醇识别氨基酸共识序列）和CCM（胆固醇共识基序）等经典基序与GPCR相互作用。但近年结构生物学研究揭示，大量胆固醇结合事件发生在非经典位点。捷克科学院生理研究所的Nikolai Chetverikov团队聚焦中枢神经系统中关键的毒蕈碱受体（muscarinic receptors）和阿片受体（opioid receptors），这两类GPCR分别调控认知、疼痛感知等生理功能，但其胆固醇调控机制存在显著差异。

研究人员采用多尺度分子动力学模拟（包括粗粒化和常规分子动力学）预测胆固醇结合位点，结合甲基-β-环糊精（MβCD）膜胆固醇耗竭实验和位点定向突变功能验证。研究对象涵盖人源M₂、M₄毒蕈碱受体和δ、κ、μ阿片受体的活性/非活性构象，通过[³⁵S]GTPγS结合实验测定功能响应。

3.1-3.3 分子动力学揭示非经典结合位点

模拟发现8个胆固醇结合腔，其中TM6-TM7沟槽（i6-i7位点）为两类受体共有。该位点以R^6.35为关键残基，通过氢键固定胆固醇分子。有趣的是，胆固醇在毒蕈碱受体中优先结合非活性构象（结合频率提高26%），而在阿片受体中偏好活性构象（结合频率提高28%）。这种构象选择性与TM6的波动性（RMSF）变化直接相关。

3.4-3.5 功能实验验证调控机制

MβCD处理使膜胆固醇降低62%后，毒蕈碱受体基础活性上升18%、最大响应增加20%，而阿片受体基础活性下降13-44%、最大响应降低20-50%。将R^6.35突变为丙氨酸或谷氨酰胺后，两类受体的功能变化与胆固醇耗竭效果一致：毒蕈碱受体激活增强，阿片受体响应减弱。特别值得注意的是，胆固醇耗竭对突变受体的影响发生逆转，提示存在R^6.35依赖与非依赖的双重调控途径。

4.讨论与意义

该研究首次阐明胆固醇通过TM6上的非经典位点实现受体亚型特异性调控的分子机制。从结构角度看，P^6.50引起的TM6弯曲形成"倾斜结合域"，使R^6.35能动态捕获胆固醇分子。从功能角度看，这种调控具有"分子开关"特性：在毒蕈碱受体中稳定非活性构象（负向调控），在阿片受体中稳定活性构象（正向调控）。

这一发现为组织特异性药物设计开辟了新途径。由于神经元和平滑肌细胞的胆固醇含量差异可达3倍，针对胆固醇结合位点开发的神经类固醇药物可能实现中枢与外周的选择性作用。例如，孕烷醇酮硫酸盐等神经甾体可通过该位点增强毒蕈碱受体功能，而某些合成甾体已显示激活μ阿片受体的潜力。此外，该研究为理解阿尔茨海默病（胆碱能系统失调）和疼痛管理（阿片系统调控）中的膜微环境变化提供了新视角。

论文的创新性在于突破传统CRAC/CCM基序的局限，揭示GPCR调控的"第三种模式"——通过构象选择性的非经典位点实现双向调控。这种机制可能普遍存在于其他GPCR中，为理解受体药理学的组织差异性提供了重要理论基础。