纤毛细胞通过高效胞内激活血凝素增强甲型流感病毒的高感染潜力

这篇研究揭示了甲型流感病毒(IAV)血凝素(HA)蛋白的蛋白酶激活机制与细胞嗜性间的关键联系。通过人气管上皮细胞(HTEC)气液界面(ALI)模型，发现纤毛细胞对HA的激活效率显著高于非纤毛细胞，且激活过程始于高尔基体。研究阐明了宿主蛋白酶抑制剂(如nafamostat)的疗效受限于亚细胞定位，为靶向TMPRSS2的宿主导向抗病毒策略提供了新见解。

　　

纤毛细胞促进甲型流感病毒高感染潜力的机制

ABSTRACT

流感病毒利用宿主蛋白酶将病毒融合蛋白血凝素(HA)激活为融合活性形式。研究使用分化的人气道上皮细胞模型，发现H1N1和H3N2毒株的HA激活效率存在细胞类型依赖性——纤毛细胞的激活效率显著高于非纤毛细胞。激活过程始于高尔基体，这限制了宿主导向蛋白酶抑制剂的抗病毒效果。

INTRODUCTION

包膜病毒依赖融合蛋白跨膜递送基因组。对于甲型流感病毒，HA蛋白的单碱性切割位点需要宿主丝氨酸蛋白酶（如TMPRSS2）的激活。既往研究对HA激活的亚细胞定位存在争议，且不同气道细胞类型的激活效率差异尚未阐明。

RESULTS

高效HA激活支撑高感染潜力

气液界面培养的人气管上皮细胞(HTEC)释放的病毒中，HA激活率超过90%。通过MDCK细胞制备的梯度激活病毒证实，感染潜力与HA三聚体完全激活率呈立方关系——当单体激活率超60%时，感染效率呈非线性增长。

靶向HA和宿主蛋白酶的抑制策略

AlphaFold2预测显示，抗体FI6v3和FISW84可通过空间位阻阻碍TMPRSS2识别HA切割环。实验证实FISW84 Fab片段能部分抑制HA激活，但在HTEC中效果有限。在宿主蛋白酶抑制剂筛选中，细胞渗透性药物nafamostat（100 nM）对H1完全抑制，而膜不通透的Kunitz型抑制剂（如大豆胰蛋白酶抑制剂STI）需超高浓度（250 μM）才有效，提示胞内激活的关键作用。

HA激活始于分泌途径早期

免疫沉淀高尔基体膜组分发现，CA09和BR07毒株的HA在^cis-高尔基体已出现切割。表面生物素化实验显示，顶端膜HA的激活程度与释放病毒相当。活细胞成像显示STI可内化至内体区室，印证了蛋白酶在胞内循环的假说。

纤毛细胞是高效HA激活者

单细胞RNA测序显示，杯状细胞和club细胞高表达TMPRSS2/TMPRSS4等蛋白酶。通过IL-13诱导的MUC5AC⁺细胞分化模型和2周/4周ALI培养比较，证实纤毛化程度与HA激活效率正相关。创新性单病毒成像技术（使用pH敏感抗体FI6v3^AF488/S1V2-72^AF555）揭示，纤毛细胞表面病毒的HA_post/HA_pre比值显著高于非纤毛细胞。

DISCUSSION

研究建立了HA激活效率与病毒传染性的定量关系，揭示纤毛细胞通过高效胞内激活增强病毒适应性。该发现为理解流感病毒细胞嗜性提供了新维度——受体结合偏好（α-2,6-唾液酸）与蛋白酶激活效率共同塑造感染格局。针对TMPRSS2的抑制剂设计需考虑亚细胞定位，而靶向HA切割环的抗体可能受限于空间可及性。

MATERIALS AND METHODS

关键技术包括：1）反向遗传学拯救病毒；2）原代HTEC气液界面培养；3）高尔基体免疫沉淀；4）基于AlphaFold2的HA0-TMPRSS2复合物建模；5）单病毒比率成像技术。所有实验均使用来自多供体的细胞进行验证，统计学分析采用Python SciPy实现。