21例临床样本中梅毒螺旋体亚种外膜蛋白组变异分析：表面暴露区域主导序列多样性

这篇研究通过靶向测序技术分析了21株梅毒螺旋体亚种（TPA）临床菌株的25个外膜蛋白（OMP）编码基因，揭示了OMPeome的高频变异特征。研究采用长读长测序（MinION）克服了基因组重复区域测序难题，发现94.8%的新等位基因编码变异蛋白序列，其中82/95的突变位点位于预测的表面暴露区域，证实了宿主免疫压力驱动的适应性进化。该成果为全球多组分梅毒疫苗的靶点筛选提供了重要数据支撑。

　　

ABSTRACT

梅毒是由苍白密螺旋体亚种（TPA）引起的性传播疾病，尽管抗生素治疗有效，但全球发病率持续攀升。本研究旨在通过分析TPA外膜蛋白（OMP）的变异特征，为多组分疫苗开发提供依据。团队开发了针对25个靶标（含15个OMP基因）的长读长测序方案，成功对21株临床菌株（主要来自欧洲）进行测序。在525个扩增子中，462个（88%）被测序，鉴定出58个新等位基因，其中55个（94.8%）编码变异蛋白序列。这些变异主要体现为单氨基酸替换（50例）、2-3个氨基酸替换（35例）及≥4个残基差异（14例，含6例重组事件）。值得注意的是，地理来源相同的菌株即使具有相同等位基因谱（AP），仍存在多位点差异，提示地理因素显著影响菌株遗传多样性。

IMPORTANCE

研究强调了分析不同地理来源TPA临床样本对理解OMP变异的重要性。

INTRODUCTION

TPA作为梅毒的病原体，全球年新增病例约700万例。尽管青霉素治疗显著降低了发病率，但新世纪以来梅毒在美、中、欧等地再度暴发。疫苗开发需解决两个关键问题：表面暴露疫苗候选抗原的鉴定及其在流行株中的抗原多样性。现有TPA基因组数据因重复/旁系同源区域测序困难存在大量缺口。TPA的OMPeome包含参与外膜组装的BamA/TP0326和LptD/TP0515、4个8链β-桶孔蛋白（8sβb）、5个长链脂肪酸转运蛋白（FadLs）、4个外膜因子（OMFs）及多个Tpr蛋白。本研究新增了家族15的纤维连接蛋白结合蛋白等靶点，通过MLST预选的21株菌株（20株SS14型，1株Nichols型）展开分析。

MATERIALS AND METHODS

样本选自PubMLST数据库，覆盖捷克、法国、荷兰等多国2006-2020年分离株。采用并行全基因组扩增（REPLI-g试剂盒）和巢式PCR扩增目标区域，通过MinION测序（SQK-LSK109建库试剂盒）获取数据。使用Guppy进行碱基识别，经Canu、Medaka和Racon算法组装抛光，通过AlphaFold3和trRosetta构建OMP三维模型，并利用Clustal Omega进行序列比对。

RESULTS

1. 1.

   扩增与测序效率：25个位点在4株菌中全部测序成功，TP0479等位点扩增效率最低。

2. 2.

   遗传变异特征：58个变异中单核苷酸变异（SNV）占49例，另发现2例移码突变、1例96 nt缺失及15例短重复序列差异。TP0548等位基因变异最显著（13种），TP0136和TP0967各7种。

3. 3.

   蛋白变异与重组：99个位点编码新蛋白序列，其中TP0548（FadL家族）和TP0967（OMF家族）变异最显著。发现6个重组位点，包括TP0462的新型串联重复。

4. 4.

   结构定位：AlphaFold3模型显示，BamA的14个变异残基全部位于胞外环（ECLs），TP0515的R456C突变在6/17菌株中出现。FadLs中47/60变异为Nichols型特有，OMFs的突变则集中于ECL1/2。

DISCUSSION

研究首次系统揭示了TPA临床株OMPeome的变异模式：

• •

  地理隔离驱动微进化：相同AP菌株存在多位点差异，如AP 1.1.1的3株菌在TP0462等位点差异显著。

• •

  免疫选择压力证据：82个表面暴露突变与宿主免疫应答相关，其中TP0548（FadL）和TP0967（OMF）可能为关键免疫逃逸靶点。

• •

  疫苗设计启示：TP0326等保守结构域或成广谱疫苗候选，而高频变异的ECLs需纳入多价疫苗设计。

创新性：

1. 1.

   建立针对TPA复杂基因组的靶向测序流程

2. 2.

   首次绘制OMP表面变异热点图谱

3. 3.

   发现TP0462新型重组事件

局限性：样本主要来自欧洲，需纳入更多地理区域菌株验证结论普适性。未来研究将聚焦变异位点与临床表型关联，为疫苗开发提供精准分子靶标。