基于活细胞成像技术的快速神经毒性检测方法

神经毒性研究：守护神经系统健康的防线

在快速发展的医学与生物学领域，神经毒性研究因其广泛的潜在影响而备受瞩目，广泛应用于环境科学、药物研发、食品安全等多个领域，旨在评估各类化学物质、药物或环境因素对神经系统可能造成的负面影响：

• 环境科学：评估污染物对神经系统的潜在危害

• 药物研发：确保新药安全性，筛选低神经毒性药物

• 食品安全：揭示食品中可能存在的有害成分

鉴于环境污染、职业暴露、药物副作用等因素导致的神经毒性问题严重威胁健康，因此开发高效评估方法显得尤为重要。

神经毒性研究：从传统到创新的跨越

传统神经毒性研究方法多依赖于动物实验和细胞培养观察，虽然这些方法在一定程度上揭示了神经毒性的基本机制，但存在成本高、周期长和通量低等局限性。近年来，随着生物技术的飞速发展，高通量筛选、基因编辑及自动化成像等创新技术逐渐应用于神经毒性研究领域，极大地提高了研究的效率与准确性。

安捷伦BioTek自动化成像系统：神经毒性研究的新利器

在本月更新的应用说明中，安捷伦开发了一种简单、快速且可靠的高通量评估方法，用于神经毒性测试与化合物筛选。该方法利用iPSC衍生的神经元作为模型，通过钙黄绿素AM标记活细胞，结合自动化成像与分析技术，实现对神经元形态与活力的实时监测，高效地量化神经细胞的存活率和神经突生长情况。

图1. 实验流程及时间安排。将神经元接种至 384 孔板中，约 3 小时后添加待测药物。药物暴露48 小时后，添加活细胞染料，并使用安捷伦 BioTek Lionheart FX自动化显微镜或者Cytation进行成像。随后，通过安捷伦 BioTek Gen5 软件结合神经突生长模块对成像数据进行图像分析，以评估细胞活力与神经元生长情况。此外，剂量反应分析能够自动量化不同化合物及其浓度条件下的细胞活力和生长测量值。

实验中，我们针对 15 种具有不同作用机制的潜在神经毒物，在 48 小时药物暴露后，对其可能产生的影响进行了评估，并通过剂量依赖性的 EC/IC50 分析，进一步量化了这些化合物对神经元活性和形态特征（如神经突长度、分支数量等）的具体影响。

图2. 预实验：荧光素 AM 方法用于细胞活力及神经突生长检测的验证。

图3. 剂量依赖性的神经突生长与存活率分析及Z分数。(A) 用钙黄绿素AM标记的iPSC衍生神经元培养物，并用不同浓度的十字孢碱处理。软件识别并标记神经元胞体（黄色）和神经突（青色）。(B) 至 (E) 展示了十字孢碱处理对胞体数量（B）、神经突长度(C)、神经突分支(D)及神经突数量(E)等生长形态特征的剂量反应曲线。(B)至(D)的图示，数据点表示每个浓度的重复孔（n=4）的平均值和标准差，叠加了四参数拟合曲线（实线）和相应的EC/IC50插值曲线（虚线）。(F) 十字孢碱浓度范围内绘制的存活率和神经元形态指标的Z分数。数据点表示每个浓度的重复孔（n=4）的平均值和标准差，叠加了四参数拟合曲线（实线）和相应的IC50插值曲线（虚线）。Z分数在-2.3至2.3之间（灰色高亮）的处理组被认为与对照组无显著差异。

图4. 抑制神经突生长的神经毒性处理。A 至 H上部为添加标记的细胞图像：神经元胞体（黄色）和神经突骨架（青色）。A 至 H下部为每种处理的存活率和神经元形态参数的剂量 - 反应分析，包括胞体计数（存活率，红色）、神经突长度（绿色）、神经突分支（蓝色）以及每个细胞的神经突数量（神经突计数，粉色）。数据点表示重复孔 Z 分数值的平均值和标准偏差（n = 4），实线表示四参数拟合，虚线表示 EC/IC50 插值。空心圆表示未纳入拟合的值。

图5. 通过图像和剂量反应分析，展示了四种不影响神经突起生长的神经毒性处理对神经元存活率和形态（包括胞体数量、神经突起长度、分支及数量）的影响，并通过Z分数和EC/IC50值进行了量化。

实验结果显示，该方法能够准确区分不同浓度神经毒素处理下神经元的形态变化与活力状态。通过剂量-效应关系分析，研究人员能够直观地观察到神经毒素对神经元生长与活性的抑制作用，并据此评估化合物的神经毒性潜力。此外，该方法还展现出良好的重现性与普适性，适用于多种神经元模型与神经毒素的筛选研究。

研究方法亮点

• 高效标记与成像：钙黄绿素AM能够迅速穿透细胞膜，对活细胞进行标记，无需复杂的预处理步骤，大大缩短了实验周期。同时，安捷伦BioTek Lionheart FX自动化显微镜和Cytation 细胞成像多功能微孔板检测系统具备宽视野成像能力，能够一次性捕获大量细胞图像，提高数据通量。

• 精准量化分析：Gen5神经突生长模块内置了优化的图像分析算法，能够自动识别并量化神经元的形态参数，如神经突长度、分支数量等，为神经毒性评估提供了客观、量化的指标。

• 多通道荧光成像：除了钙黄绿素AM外，该系统还支持多种荧光标记物的同时成像，如死细胞标记物eTox Red等，进一步丰富了实验数据的维度与深度。

• 高通量与自动化：借助384孔板，能够规模化地推进神经毒性与药物筛选工作。在这一过程中，15种待测物质得以同步处理与监测，不仅大幅提升了实验效率，而且确保了所有实验条件完全一致，从而显著增强了实验数据的可比较性和可靠性。

借助高通量自动化显微镜技术，神经毒性研究方法实现了规模化与高度重复性，确保了研究的可行性和高效性。