在线监测线粒体呼吸活性与蛋白质合成：揭示植物源无细胞表达系统ALiCE的能量代谢机制

为解决复杂重组蛋白生产瓶颈，研究人员通过μRAMOS-BioLector联用技术首次实现烟草BY-2细胞源ALiCE无细胞表达系统的在线监测，揭示氧气供给与线粒体呼吸链（AOX/复合体IV）对蛋白质合成效率的关键调控作用，为规模化生产糖基化蛋白提供理论依据。

　　

在生物医药领域，重组蛋白的需求正以惊人速度增长，从疫苗组分到诊断试剂，目前已有超过170种复杂重组蛋白应用于临床。然而传统细胞表达系统面临诸多挑战：难以表达细胞毒性蛋白、生产周期长、真核系统难以实现规模化等。无细胞蛋白合成（Cell-free protein synthesis, CFPS）技术因其无需活细胞、反应条件可控等优势，成为解决这些痛点的突破口。其中基于烟草BY-2细胞的ALiCE（Almost Living Cell-free Expression）系统尤为突出，不仅能实现3μg/μL的蛋白产量，还保留细胞器功能可进行糖基化等翻译后修饰。但制约其产业化的关键问题在于——这个"半活体"系统的能量代谢机制究竟如何？氧气供给与线粒体功能如何影响蛋白产出？

为揭开这一谜团，德国亚琛工业大学与LenioBio GmbH的研究团队在《BMC Biotechnology》发表创新成果。研究采用工程化改造的在线监测系统，首次实现对ALiCE系统中氧气消耗、蛋白合成与能量代谢的实时追踪。通过设计氧梯度实验和线粒体抑制实验，揭示了呼吸链活性与蛋白质合成的定量关系。

关键技术方法包括：1）构建μRAMOS-BioLector联用装置，同步监测氧传递速率（OTR）、eYFP荧光和NADH水平；2）利用48孔深孔板建立不同氧供给条件（300-1200μL体积梯度）；3）采用线粒体特异性抑制剂（SHAM抑制替代氧化酶AOX，KCN抑制细胞色素c氧化酶）；4）通过E.coli校准曲线计算最大氧传递容量（OTR_max）；5）使用商业批次LYCDAV11SC等ALiCE裂解液体系。

【Establishing online monitoring for the lysate reaction】

研究团队首先验证了监测系统的可靠性。与传统96孔半区板相比，48孔圆底板中eYFP产量达3.1±0.2μg/μL且提前8小时达峰。在线数据显示，OTR初始即达17 mmol/L/h的高平台期，表明裂解液中蛋白合成机器处于持续活跃状态。值得注意的是，无模板对照（NTC）的氧消耗与实验组相当，但NADH水平显著降低，暗示蛋白合成会重塑能量代谢网络。

【Oxygen availability determines the kinetics of the lysate reaction】

通过调整装液体积（300-1200μL）构建氧梯度发现，当OTR_max低于7.5 mmol/L/h（对应1200μL）时，eYFP产量骤降50%。在最佳氧供给（OTR_max=20 mmol/L/h）条件下，空间时间产率（STY）提升2倍至0.91 a.u./h。特别发现600μL组虽出现氧限制（OTR=16 mmol/L/h），但eYFP仍持续积累，表明成熟过程不受溶解氧（DOT）影响。

【Intact mitochondria are responsible for respiratory activity】

线粒体抑制实验揭示：10 mM SHAM（AOX抑制剂）使eYFP产量降低60%，NADH显著积累；50 mM SHAM则完全抑制呼吸活性。1000μM KCN（复合体IV抑制剂）造成18小时表达停滞，但随着HCN挥发功能逐渐恢复。这表明AOX对维持氧化还原平衡至关重要，而复合体IV的抑制可通过AOX代偿。

这项研究首次绘制出植物源CFPS系统的能量代谢图谱，证实线粒体呼吸链是ALiCE系统的"动力引擎"。特别值得注意的是，AOX作为植物特有氧化酶，在维持系统稳定性方面发挥不可替代的作用。研究提出的OTR_max≥20 mmol/L/h的工程化参数，为200L规模生物反应器设计提供了关键依据（40L工作体积，100 rpm）。该成果不仅解决了无细胞系统中能量代谢的"黑箱"问题，更为复杂真核蛋白的工业化生产铺平了道路，特别是在需要糖基化修饰的抗体药物生产领域展现出巨大潜力。